1、研究背景與目的：
　　 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)是我國南方省份及東南亞高發(fā)的一種惡性腫瘤,具有明顯的種族聚集性和地域性。其發(fā)生是一個多階段、多途徑、多機制的過程。流行病學調查顯示,鼻咽癌的發(fā)生涉及到遺傳傾向性和環(huán)境致癌因素,很可能是遺傳易感性個體接受了致癌物的作用而發(fā)生的。EB病毒(EBV)、化學致癌物和胚性擊中(即遺傳因素或自發(fā)突變)構成NPC的主要病因,而發(fā)病階段至少在兩個以上。各種環(huán)境因素

2、、EBV感染、遺傳和表遺傳學的改變導致瘤基因過表達及抑瘤基因表達下調或缺失,經(jīng)過癌前病變,最終發(fā)生鼻咽癌。
　　 腫瘤的生成涉及多種基因和基因以外的變化,任何單獨一種基因的改變不足以致瘤,多種基因變化的積累才能引起控制細胞生長和分化的機制紊亂,使細胞的生長失控而瘤變。在這些基因的變化中,最常發(fā)生兩類基因的異常變化,即瘤基因及腫瘤抑制基因。鼻咽癌的生成同樣涉及多基因的表達改變。在過去幾十年中,雖然我們對于鼻咽癌發(fā)生的分子基礎認識已

3、經(jīng)有了很大的提高,但這些認識還是遠遠不能完全揭示鼻咽癌的發(fā)病機理。因此,鼻咽癌相關新基因的發(fā)現(xiàn)和研究仍將有助于進一步揭示鼻咽癌的發(fā)病機理。
　　 NESG1基因(Genbank AF094758),官方名為CCDC19(NM_012337.1),是本課題組姚開泰教授指導的博士生黎眾魁于1999年利用mRNA差異顯示法,從人正常鼻咽上皮和軟腭口腔上皮中篩選,并結合3'-RACE和5'-RACE技術,分別擴增出長約1.4kb和0.7

4、kb的片段(其中包含了一段174bp的重疊產(chǎn)物以確認擴增的特異性),拼接后發(fā)現(xiàn)的一個全長約1850bp連續(xù)的cDNA序列。該基因位于1q22。預測其編碼框長1161bp,編碼386個氨基酸,分子量為46252Da,蛋白質等電點為9.99,SOSUI和PSORTⅡ網(wǎng)上預測其為可溶性核蛋白。BLAST比對發(fā)現(xiàn),NESG1的cDNA序列與胎兒肺組織cDNA文庫和Stratagene肺癌cDNA文庫中的兩個EST序列同源。多組織(包括鼻咽粘膜、

5、氣管、食管、大腦、心臟、膀胱、肝臟、肺臟、胃、腎臟、胸腺和大腸)Northern雜交顯示,該基因特異性的表達于鼻咽和氣管纖毛柱狀上皮。
　　 本課題在此研究基礎上,對NESG1基因進行重新克隆測序分析及功能鑒定,并尋找NESG1基因相關的信號轉導通路,探討該基因在鼻咽癌中的作用機制,為進一步闡明鼻咽癌發(fā)病機理提供參考。
　　 研究內容與方法
　　 1.NESG1基因的序列修正以及新序列的生物信息學分析
　　

6、 對NESG1基因進行了重新克隆、測序分析并對其序列進行修正,重新預測編碼框。對新校正序列進行生物信息學分析。
　　 2.NESG1基因在鼻咽癌中表達水平檢測
　　 (1).NESG1基因mRNA表達水平
　　 利用RT-PCR和Real-time PCR檢測NESG1 mRNA在鼻咽癌細胞、鼻咽癌組織與非癌鼻咽組織中的表達情況；原位雜交檢測NESG1基因的mRNA表達定位。
　　 (2).NESG1兔

7、抗人多克隆抗體制備及NESG1蛋白表達
　　 構建pGEX-4T-1-NESG1-GST原核融合表達載體。IPTG誘導NESG1-GST基因融合表達。利用GST抗體純化融合蛋白用于免疫大白兔,約100天后取兔血上清,并親和純化,最后獲得所需的NESG1多克隆抗體。利用免疫組化和Western blot檢測NESG1蛋白在鼻咽癌組織與非癌鼻咽組織中的表達情況。利用免疫組化檢測鼻咽外多組織中NESG1的表達分布。
　　 3.

8、NESG1基因在鼻咽癌中的功能初步研究
　　 (1).NESG1過表達對鼻咽癌細胞5-8F生物學特性的影響
　　 構建與增強型綠色熒光蛋白融合表達的NESG1慢病毒載體,利用293FT細胞包裝成成熟的慢病毒顆粒,感染具有高成瘤和高轉移能力的鼻咽癌細胞5-8F。96孔板有限稀釋法挑選陽性單克隆細胞,擴大培養(yǎng),建立穩(wěn)定過表達NESG1的鼻咽癌細胞株,以空載體同時進行病毒包裝及感染鼻咽癌細胞5-8F,獲得對照細胞株。利用MTT

9、法、平板克隆形成實驗、流式細胞術、Transwell小室遷移實驗及Boyden小室侵襲實驗等檢測NESG1基因在細胞水平對細胞生長、細胞周期、遷移及侵襲能力的影響；檢測穩(wěn)定過表達NESG1的鼻咽癌細胞裸鼠皮下成瘤能力的改變。
　　 (2).抑制NESG1表達對鼻咽癌細胞5-8F生物學特性的影響
　　 構建靶向NESG1的shRNA慢病毒干擾載體,穩(wěn)定干擾過表達NESG1基因的鼻咽癌細胞,利用MTT法、平板克隆形成實驗、T

10、ranswell小室遷移實驗及Boyden小室侵襲實驗等觀察NESG1表達抑制后細胞生長、遷移及侵襲能力的變化。進一步探討NESG1基因在鼻咽癌細胞中的基本功能。
　　 4.NESG1基因介導的分子基礎初步研究
　　 (1).應用Affymetrix全基因組芯片檢測NESG1基因穩(wěn)定導入前后對鼻咽癌細胞基因表達的影響,尋找差異表達基因
　　 (2).利用生物信息學的方法,分析基因芯片差異表達基因介導的信號通路

11、r>　　 (3).NESG1抑制細胞周期進展的初步分子機制
　　 由于過表達的NESG1能阻滯細胞周期由G1向S期轉化,因此,NESG1參與抑制了細胞周期的進展?；诨蛐酒臄?shù)據(jù),我們利用熒光定量RT-PCR和Western blot驗證了S期相關的幾個重要基因CCND1、CCNA1、CDK4、p21、CDK2、CDC2的表達,初步探討了NESG1基因抑制細胞周期進展的機制。
　　 結果
　　 1.NESG1

12、基因的序列修正以及新序列的生物信息學分析
　　 (1).NESG1基因的序列修正
　　 (2).序列修正后NESG1基因的生物信息學分析
　　 2.NESG1基因在鼻咽癌中表達水平檢測
　　 (1).NESG1基因mRNA表達水平
　　 原位雜交顯示,NESG1基因表達在鼻咽粘膜纖毛柱狀上皮細胞的細胞核、漿內。半定量RT-PCR和熒光定量RT-PCR均顯示,與非癌鼻咽組織相比,NESG1基因在鼻咽

13、癌組織和細胞中表達明顯下調(t=19.819,P<0.001)。
　　 (2).NESG1兔抗人多克隆抗體制備及NESG1蛋白表達
　　 3.NESG1基因在鼻咽癌中的功能初步研究
　　 (1).NESG1過表達對鼻咽癌細胞5-8F生物學特性的影響
　　 (2).抑制NESG1表達對鼻咽癌細胞5-8F生物學特性的影響
　　 4.NESG1基因介導的分子基礎初步研究
　　 (1).Affym

14、etrix全基因組表達譜芯片
　　 對NESG1-2F4和C6空載對照細胞進行Affymetrix全基因組表達譜芯片檢測,一共檢測到了2400多個差異表達基因,其中上調基因797個,下調基因1707個。將這些差異表達基因進行了初步的Pathway分析,結果顯示NESG1基因參與多條信號轉導途徑,其中包括Tight junction、MAPK通路和Cell cycle通路等。
　　 (2).NESG1抑制細胞周期進展初步機

15、制研究
　　 結論
　　 1.修正了NESG1基因的序列,使其在Genbank數(shù)據(jù)庫中的版本由最初的NM_012337.1升級為NM_012337.2。
　　 2.NESG1穩(wěn)定導入鼻咽癌細胞5-8F后,細胞的體內、外增殖、遷移和侵襲能力顯著下降,在NESG1表達更強的2F4細胞中,細胞出現(xiàn)了G1向S期轉化障礙,細胞阻滯在G1期。在抑制NESG1表達后,細胞增殖能力、遷移和侵襲能力顯著恢復。這提示,NESG1在鼻

16、咽癌中是一個腫瘤抑制相關基因。
　　 NESG1通過抑制CCNA1和上調p21的表達,參與了鼻咽癌細胞周期進展的調控。
　　 本研究創(chuàng)新之處
　　 1.修正了NESG1基因的序列,更新了NESG1在Genbank數(shù)據(jù)庫中的版本號。
　　 2.對NESG1基因進行了表達定位,在mRNA和蛋白水平證實了NESG1基因在鼻咽癌中表達下調,為理解和研究鼻咽癌發(fā)病的分子機制提供了線索。
　　 3.初步證實N

17、ESG1基因與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關,能夠抑制鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力,并且將細胞阻滯在G1期。
　　 4.基因芯片分析顯示,NESG1參與介導了Tight junction、MAPK和Cell cycle等多條信號通路,這為研究NESG1在鼻咽癌中介導的信號通路提供了關鍵的線索。
　　 5.NESG1抑制CCNA1的表達和上調p21的表達,阻礙了鼻咽癌細胞的細胞周期進展。
　　 6.NESG1基因是本