1、目的：①應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 cDNA文庫(kù)中可與LRP16相互作用的蛋白；②確認(rèn)LRP16與AR等核受體及NF-κB的相互作用；③研究LRP16對(duì)AR轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞系LNCap在不同濃度雄激素刺激下增殖的影響；④觀察雄激素對(duì)LRP16表達(dá)的調(diào)控作用。 方法：①pLPC-LRP16質(zhì)粒經(jīng)酶切、瓊脂糖凝膠電泳、回收，獲得LRP16的基因片段，將其連接至酵母雙雜交系統(tǒng)誘餌載體pGBKT7中

2、，經(jīng)酶切驗(yàn)證其正確插入方向后，將重組誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌AH109和Y187，并檢測(cè)其在酵母中有無(wú)自激活作用和毒性。隨后提取轉(zhuǎn)化后的酵母總蛋白，經(jīng)Western blot檢測(cè)誘餌質(zhì)粒在酵母中的表達(dá)情況，以鑒定其作為誘餌蛋白的可行性。②將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LRP16、MCF-7 ds cDNA文庫(kù)片段及線性化質(zhì)粒pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)上篩選陽(yáng)性菌落。

3、提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物測(cè)序，并將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top10獲得與誘餌質(zhì)粒有相互作用的單個(gè)丈庫(kù)質(zhì)粒，測(cè)序后回復(fù)驗(yàn)證其在酵母中的相互作用。③用免疫共沉淀(Co-IP)及GST pull-down等體內(nèi)、體外的方法驗(yàn)證LRP16與AR-T-27的相互作用；進(jìn)一步采用GST pull-down確認(rèn)LRP16與AR等核受體及NF-κB直接的相互作用，并驗(yàn)證了LRP16與AR相互作用的結(jié)構(gòu)域；④熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)LRP

4、16對(duì)AR轉(zhuǎn)錄激活的影響及AR對(duì)LRP16啟動(dòng)子的調(diào)控作用；⑤采用MTT檢測(cè)抑制內(nèi)源性LRP16在不同雄激素濃度刺激下對(duì)LNCap增殖的影響；⑥在不同濃度及不同作用時(shí)間點(diǎn)睪酮刺激下，用Western blot檢測(cè)LRP16蛋白表達(dá)水平的變化及在不同前列腺癌細(xì)胞系LRP16的表達(dá)情況。 結(jié)果：①重組誘餌質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證，片段大小和插入方向均正確，將其轉(zhuǎn)化入酵母菌后無(wú)自激活作用和毒性，Western blot證實(shí)在酵母中重組誘餌質(zhì)?？?/p>

5、正確表達(dá)人LRP16蛋白；②獲得8個(gè)與LRP16相互作用的候選蛋白，選取4個(gè)在酵母中進(jìn)行回復(fù)驗(yàn)證，其中有3個(gè)可生長(zhǎng)出陽(yáng)性克隆；③ART-27可與LRP16相互作用，且AR、ERβ、PPARα、PPARγ等核受體及NF-κB均與LRP16有直接的相互作用；④LRP16通過(guò)唯一的C端結(jié)構(gòu)域與AR的LBD域相互作用；⑤在睪酮的作用下，過(guò)表達(dá)LRP16對(duì)AR的轉(zhuǎn)錄活性有增強(qiáng)作用，抑制內(nèi)源性LRP16的表達(dá)可減弱AR的轉(zhuǎn)錄激活活性；⑥減少內(nèi)源性L

6、RP16表達(dá)可抑制不同雄激素水平下LNCap細(xì)胞的增殖；⑦低濃度的睪酮可使LRP16蛋白表達(dá)增多，睪酮作用3h即可使LRP16蛋白表達(dá)增多，且AR對(duì)LRP16啟動(dòng)子活性存在增強(qiáng)作用；⑧AR陽(yáng)性的前列腺癌細(xì)胞系LNCap比AR陰性的前列腺癌細(xì)胞系DU145中LRP16蛋白含量高。 結(jié)論：①應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選出-族功能基本明確的可與LRP16相互作用的候選蛋白；②LRP16可與AR、NF-κB直接相互作用，且這種相互作用不依賴于