1、菊科植物向日葵具有較高的經(jīng)濟(jì)和食用價(jià)值，也是我國(guó)重要的油料作物之一。近些年來(lái)，隨著我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)向日葵種子量的增多，增大了其種子上攜帶的多種危險(xiǎn)性病害傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)。向日葵黑莖病(Leptosphaeria lindquistii)是向日葵的一種重要檢疫性真菌病害。椐報(bào)道，此病害在我國(guó)新疆等局部地區(qū)時(shí)有發(fā)生。目前，世界各國(guó)對(duì)向日葵黑莖病的研究多集中在形態(tài)鑒定和和分子檢測(cè)等方面，雖然有田間不同向日葵品種對(duì)黑莖病抗性的調(diào)查統(tǒng)計(jì)分析，但對(duì)于黑

2、莖病菌侵染向日葵后的生物脅迫生理響應(yīng)的研究報(bào)道甚少。抗感向日葵品種在控制條件下，對(duì)接種黑莖病菌的生理響應(yīng)差異研究，如抗氧化酶系統(tǒng)活性、活性氧產(chǎn)生能力、抗氧化酶酶譜的變化及其與抗病性的相關(guān)性還未見(jiàn)有報(bào)道。
　　本研究選擇對(duì)黑莖病易感(康地KWS303)和高抗(MT792G)的向日葵品種，在控制條件下對(duì)其幼苗期接種從新疆田間分離并經(jīng)ITS分子鑒定了的黑莖病分離物(BXC1)，研究抗感品種對(duì)黑莖病分離物的生理響應(yīng)差異。
　　對(duì)在人

3、工生長(zhǎng)箱萌發(fā)生長(zhǎng)至出現(xiàn)2片真葉（大約2周）的幼苗的下胚軸接種菌齡1周的BXC1培養(yǎng)物。接種方式有無(wú)損傷接種、針刺損傷接種，同時(shí)設(shè)置無(wú)損傷非接種和損傷非接種兩個(gè)對(duì)照。接種后繼續(xù)培養(yǎng)10天后觀測(cè)記錄感染情況（染病率及病斑大小統(tǒng)計(jì)），以比較抗感向日葵品種不同接種方式的感染情況;并對(duì)其進(jìn)行基于ITS的向日葵黑莖病雙重PCR分子檢測(cè)實(shí)用化研究，從分子水平確證黑莖病的感染，以便進(jìn)行后續(xù)生理響應(yīng)差異研究;對(duì)各種接種處理的植株各部（根、莖和葉）的酶類(lèi)(

4、SOD、POD、CAT、PAL和GSH-Px)活性、活性氧(O2-、·OH、H2O2)水平以及同工酶(SOD、POD和EST)譜進(jìn)行了分析。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.了解了不同接種方式對(duì)向日葵抗感品種感病的差異分析向日葵抗感品種在苗期控制條件下，以不同接種方式接種黑莖病菌BXC110d后的病斑特點(diǎn)、感病率、病斑大小（長(zhǎng)、短徑）發(fā)現(xiàn)，針刺損傷接種更易使向日葵感染黑莖病;在相同接種模式下，向日葵感性品種產(chǎn)生黑莖病病斑較抗性品

5、種的黑莖病病斑顏色更深、感病率更高、病斑更大;同時(shí)發(fā)現(xiàn)向日葵對(duì)黑莖病菌的抗性是部分抗性;黑莖病菌株BXC1對(duì)向日葵抗感品種的有效接種方式為針刺損傷接種，這為后期研究抗感向日葵對(duì)黑莖病的生理響應(yīng)及抗性生理機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　2.建立起了基于ITS的向日葵黑莖病雙重PCR實(shí)用檢測(cè)體系由于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)向日葵黑莖病的檢測(cè)主要是根據(jù)其形態(tài)來(lái)進(jìn)行鑒定，依據(jù)其ITS及actin基因的傳統(tǒng)和多重PCR分子檢測(cè)也有報(bào)道，但大多采用的是分離純化的菌

6、株進(jìn)行的檢測(cè)方法探索，未對(duì)其檢測(cè)靈敏度及組織帶菌檢測(cè)的實(shí)用化進(jìn)行研究。本研究采用我們從新疆田間分離并經(jīng)ITS序列擴(kuò)增、測(cè)序鑒定了的黑莖病菌株BXC1為供試菌，進(jìn)行了其雙重PCR分子檢測(cè)、靈敏度試驗(yàn)以及模擬帶菌組織的分子檢測(cè)，然后用此菌株采用不同接種方式人工接種兩種向日葵品種幼苗，待其出現(xiàn)典型癥狀時(shí)，對(duì)其進(jìn)行雙重PCR實(shí)際檢測(cè)。結(jié)果表明，無(wú)論是黑莖病菌基因組DNA還是其與向日葵基因組的混合DNA都能擴(kuò)增出真菌的ITS區(qū)特異帶(580bp)

7、和黑莖病菌actin基因的特異帶(255bp)，且混合DNA還能擴(kuò)增出向日葵的ITS特異帶(約740bp)。說(shuō)明向日葵黑莖病菌的此種雙重PCR分子檢測(cè)方法具有很好的特異性;梯級(jí)稀釋真菌DNA或向日葵基因組DNA或其混合DNA模板的雙重PCR檢測(cè)表明，在20μL PCR反應(yīng)體系中，黑莖病菌DNA的檢測(cè)靈敏度均為0.05 ng/μL;凡是接種了BXC1的向日葵，其帶菌組織DNA均能檢測(cè)出向日葵與黑莖病的ITS序列以及黑莖病actin基因特異

8、條帶。這些結(jié)果表明，此向日葵黑莖病菌的雙重PCR檢測(cè)體系特異、可靠、便捷，可對(duì)帶菌向日葵組織進(jìn)行直接快速分子檢測(cè)。
　　3.抗感向日葵品種接種黑莖病菌后對(duì)重要酶類(lèi)活性的響應(yīng)差異試驗(yàn)表明，抗感向日葵接種了黑莖病分離物BXC1的幼苗的根、莖和葉中SOD、POD、CAT、PAL、GSH-Px的活性都顯著高于相應(yīng)對(duì)照組，損傷接種要高于無(wú)損傷接種。可見(jiàn)這些酶類(lèi)是向日葵對(duì)黑莖病菌響應(yīng)酶類(lèi)，與向日葵對(duì)黑莖病的部分抗性有著密切的關(guān)系。
　　

9、4.抗感向日葵品種接種黑莖病菌后活性氧水平的差異抗感向日葵接種了黑莖病分離物BXC1的幼苗的根、莖和葉中產(chǎn)生的活性氧（超氧自由基、羥基自由基和過(guò)氧化氫）均有所降低，這些活性氧水平的變化與其相關(guān)抗氧化酶的活性變化趨勢(shì)基本一致，且抗性向日葵的降低幅度要比感性向日葵的降幅要大，這也許是抗性的可能原因之一。
　　5.抗感向日葵品種接種黑莖病菌后酶譜差異分析初步認(rèn)為，SOD酶帶S3的活性強(qiáng)弱很可能與向日葵對(duì)黑莖病菌的響應(yīng)和抗性有關(guān);在出現(xiàn)病

10、癥的莖中，感性品種接種后POD酶譜出現(xiàn)了P3帶，同時(shí)P2和P3兩條帶活性明顯較對(duì)照增強(qiáng)?？剐云贩N有特異的活性較強(qiáng)的P4和P5兩條帶，且隨損傷接種強(qiáng)度的增加， P2、P4和P5的活性逐漸增強(qiáng)。初步認(rèn)為，P4～5的活性強(qiáng)弱很可能與向日葵對(duì)黑莖病菌的抗性有關(guān)，而P2和P3可能與向日葵對(duì)黑莖病菌的響應(yīng)有關(guān);EST同工酶譜分析表明，在出現(xiàn)病癥的莖中，感性品種出現(xiàn)了E3、E5、E6帶，且接種處理后，譜帶有所增強(qiáng)，而抗性品種只有E5和E6兩條帶，隨著

11、接種處理譜帶明顯增強(qiáng)，且譜帶活性明顯高于感性品種，E3，E5和E6可能和抗、感品種對(duì)黑莖病的病理響應(yīng)和抗性有關(guān)。
　　6.黑莖病菌茵絲的酶活性、活性氧含量及酶譜特點(diǎn)向日葵黑莖病分離物BXC1菌絲具有較高的SOD和非常高的GSH-Px酶活性，但其POD、CAT和PAL的活性卻非常低。
　　BXC1菌絲有較高的超氧自由基產(chǎn)生能力、較高的·OH濃度和非常高的H2O2含量，這可能是菌絲具有非常低的POD和CAT活性和其·OH/H2O

12、2含量很高的原因，這也極有可能是其侵染傷害向日葵使其致病的原因之一。
　　黑莖病BXC1菌絲也表現(xiàn)出2條SOD譜帶（SLL1和SLL2）和6條EST譜帶(E1～6)，其中有三條帶比較強(qiáng)（E3，E5和E6），但卻沒(méi)有檢測(cè)到有POD酶譜帶。這與活性測(cè)定時(shí)菌絲含有較高的SOD活性、而其POD活性極低是一致的;有趣的是，在菌絲中存在的2條SOD譜帶，在感病病癥部的莖中卻沒(méi)有出現(xiàn)，很有可能，在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌絲與侵入宿主體內(nèi)的菌絲生長(zhǎng)