1、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H．pylori）是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，并與黏膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤（MALT）及胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，H．pylori感染嚴重危及人類的健康，因此，如何有效控制H．pylori感染亟需解決，但至今還沒有一種單一的抗生素可根除H．pylori感染，二聯(lián)抗生素療法對H．pylori的根除率也不高，目前，臨床抗H．pylori治療多采用在質(zhì)子泵抑制劑（PPI）或膠體鉍劑的基礎(chǔ)上加

2、兩種抗生素的三聯(lián)療法，常用抗生素包括甲硝唑（Metronidazole，MTZ）、克拉霉素（Clarithiomycin，CLA）、阿莫西林（Amoxicilin，AMX）。然而，近年來隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，H．pylori對抗生素產(chǎn)生耐藥性呈上升趨勢，耐藥性的產(chǎn)生是根除H．pylori失敗的重要原因。 甲硝唑（Metronidazole，MTZ）是H．pylori三聯(lián)及四聯(lián)療法中常用的抗生素，屬于硝基咪唑類藥物，其本身為一種無

3、抑菌活性的藥物前體，需在細胞內(nèi)被硝基還原酶激活后才能發(fā)揮滅菌作用。由于MTz在人體內(nèi)具有活性高、穩(wěn)定性強及價格便宜等優(yōu)點，因而成為根除H．pylori感染的首選藥物之一，然而，MTZ的耐藥率在幾種治療H．pylori的抗生素中居高，H．pylori對甲硝唑的耐藥降低了包含有MTZ治療方案的療效，從而成為根治H．pylori失敗的重要原因。目前主要認為：H．pylori通過基因突變或基因表達調(diào)控，使作用于細菌的硝基還原酶含量降低，從而阻止

4、或抑制MTZ轉(zhuǎn)化為使細菌致死的還原產(chǎn)物，最終導致細菌對藥物的耐受。大多數(shù)研究推斷甲硝唑耐藥可能與rdxA、frxA、fdxB基因突變密切相關(guān)，它們分別編碼氧不敏感的NADPH硝基還原酶、NADPH黃素氧化還原酶和鐵氧還原蛋白類似物。但也有研究者發(fā)現(xiàn)這些基因在部分敏感株和耐藥株中的表達一致，這提示MTZ耐藥株的形成過程中可能存在其它基因的參與，因此有必要進一步研究H．pylori對MTZ耐藥的新機制。 研究H．pylori對甲硝唑

5、的耐藥機制實際上就是揭示藥物作用細菌后信號轉(zhuǎn)導機制。基于基因組學技術(shù)的研究存在局限性，即使捕獲到細菌內(nèi)mRNA的信息仍不能代表基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的最終功能，這就需要我們從生命活動的執(zhí)行者蛋白質(zhì)入手，研究藥物干預后蛋白質(zhì)種類及數(shù)量的變化。目前蛋白質(zhì)組學研究較為流行的技術(shù)體系是應(yīng)用雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)、質(zhì)譜分析鑒定所分離的蛋白質(zhì)，應(yīng)用生物信息學數(shù)據(jù)庫對鑒定結(jié)果進行存儲、處理、對比和分析。幽門螺桿菌兩個菌株（H．pylori26695和H．py

6、loriJ99）的全基因組序列測序已經(jīng)完成，利用現(xiàn)有的生物信息學資源，本研究旨在通過高通量的蛋白質(zhì)組學技術(shù)了解幽門螺桿菌在MTZ作用下由敏感株轉(zhuǎn)化為耐藥株的蛋白質(zhì)表達模式變化，為初步闡明幽門螺桿菌耐藥性的機制奠定基礎(chǔ)。據(jù)此，我們主要做了以下工作： 1、幽門螺桿菌甲硝唑耐藥株的體外誘導和鑒定 體外培養(yǎng)幽門螺桿菌26695（H．pylori26695），并利用藥物濃度連續(xù)倍增的方法建立H．pylori26695甲硝唑耐藥株，

7、分別測定用藥前后甲硝唑?qū)．pylori26695的最低抑制濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC），MIC值變化≧32倍時被確定為誘導出對抗生素耐藥的菌株，為保證抗生素耐藥株的穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)細菌5代后進行回復實驗，再測定其MIC值，最后進行PCR擴增rdxA基因并測序檢測其是否發(fā)生突變。本研究結(jié)果證明我們成功誘導出穩(wěn)定的H．pylori26695甲硝唑耐藥株，其對甲硝唑的耐受濃度為敏感株的25

8、6倍，經(jīng)回復實驗耐藥株的MIC值前后保持一致，rdxA基因測序結(jié)果顯示3個位點發(fā)生插入突變，該工作為研究幽門螺桿菌對MTZ耐藥機制提供了實驗模型。 2、幽門螺桿菌甲硝唑敏感株與耐藥株蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜的構(gòu)建 分別收集H．pylori26695敏感株與耐藥株，提取細菌總蛋白，應(yīng)用等電聚焦電泳（IEF）將菌體蛋白質(zhì)在不同pH梯度進行分離，然后用SDS—PAGE電泳技術(shù)根據(jù)分子量的不同在聚丙烯酰胺凝膠上電泳進一步分離；通過雙

9、向凝膠電泳（2—DE）技術(shù)分離菌體蛋白，蛋白質(zhì)顯色使用銀染法，用掃描儀獲取蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜，利用ImageMastet2DElite軟件進行圖像分析，尋找敏感株與耐藥株的差異性蛋白質(zhì)斑點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在H．pylori耐藥株中有55個蛋白斑點表達差異顯著。 3、幽門螺桿菌甲硝唑敏感株與耐藥株的差異表達蛋白的質(zhì)譜鑒定 利用基質(zhì)輔助激光解吸電離—飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI—TOF—TOF）對表達差異性的蛋白質(zhì)點進行MAlD

10、I—TOF—TOF質(zhì)譜分析，共得到24個蛋白質(zhì)點的可靠信息，23個蛋白質(zhì)點在耐藥株中的表達升高，1個蛋白質(zhì)點在耐藥株中表達降低。通過網(wǎng)絡(luò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www．matrixscience．com and http：//www．expasy．ch/tools/peptident．htm）搜索對比后，這些蛋白質(zhì)分別涉及細胞生長、合成與代謝以及壓力反應(yīng)等生物學功能。本研究結(jié)果提示H．pylori26695甲硝唑耐藥株的形成涉及到多