1、背景與目的:預防結核病的卡介苗（BCG）自發(fā)明以來在全球廣泛接種，能有效預防兒童重癥結核，但對成人肺結核保護性較差。BCG主要誘導產生CD4+Th1免疫應答、且該應答隨時間延長減弱，保護期僅10~15年；誘導CD8+T細胞應答較弱，不能阻止體內潛伏感染細菌的再次激活。因此，在卡介苗已有的保護性和安全性優(yōu)勢的基礎上，擬針對卡介苗的不足改造卡介苗，用于結核病的預防，具有重要意義和實踐價值。結合結核分枝桿菌在感染機體后存在的不同狀態(tài)且表達不同

2、的抗原譜和機體抗感染的免疫保護機制，本研究擬將前期構建的、分別過表達結核分枝桿菌免疫優(yōu)勢抗原Ag85A、Ag85B和HspX的三株增強型重組卡介苗，即rBCG::85A、rBCG::85B和rBCG::X，按等比例混合，綜合利用其各自優(yōu)勢，制成“雞尾酒”重組卡介苗ABX。與親代卡介苗分別免疫小鼠，評價其抗結核分枝桿菌的短期保護效應以及比較分析疫苗的免疫原性，為完成重組卡介苗 ABX菌株的臨床前研究奠定基礎。
　　方法:1.評價重組

3、卡介苗ABX抗M.tb急性感染保護性：將rBCG::85A、rBCG::85B和rBCG::X等比例配伍，制成重組卡介苗，命名為 ABX，作為實驗組（1.02×106CFU/100μl/只）；親代BCG作為陽性對照組（1.5×106CFU/100μl/只），PBS免疫作為陰性對照組（100μl/只）。免疫C57BL/6小鼠8周后，尾靜脈注射M.tb H37Rv毒株(1.2×106CFU/只)攻擊感染。感染4周后，分別檢測小鼠肺臟和脾臟的

4、細菌載量以及病理改變，觀察存活率。
　　2.評價重組卡介苗ABX的細胞免疫應答：同上免疫C57BL/6小鼠，免疫后12周和32周后，收集脾細胞。
　?。?）ELISA檢測抗原Ag85A、Ag85B和HspX特異性的TNF-α、IFN-γ、IL-2及IL-4水平，以PPD刺激為陽性對照，RPMI1640為陰性對照。
　?。?）流式細胞儀(FCM)結合胞內因子染色法(ICS)分析抗原特異性的CD4+T細胞中分泌TNF-α+

5、、IFN-γ+、IL-2+細胞總數，進一步分析單陽、雙陽和三陽性多功能CD4+T細胞。以PPD刺激為陽性對照，RPMI1640為陰性對照。
　?。?）CFSE標記法檢測體內Ag85B特異的CD8+T細胞的CTL殺傷活性。
　　3.評價重組卡介苗ABX的免疫記憶水平：利用流式細胞術，以CD62L、CD44表達作為分選標志，分別檢測Ag85A、Ag85B和HspX抗原的CD4表位肽，Ag85B抗原CD8表位肽特異性的TCM（CD

6、62Lhi CD44hi）、TEM（CD62Llo CD44hi）水平；同時結合胞內細胞因子染色，進一步分析 TEM細胞群中分泌IFN-γ和TCM細胞群中分泌IL-2的細胞數。
　　4.評價重組卡介苗ABX的體液免疫應答：ELISA檢測小鼠血清中Ag85A、Ag85B和HspX特異性的抗體總IgG及亞類IgG1、IgG2a的水平。
　　結果:1.重組卡介苗ABX增強抗M.tb急性感染的保護性：與親代BCG免疫小鼠相比，ABX

7、組小鼠的肺臟荷菌量顯著降低（p=0.001），比BCG組減少0.585log；病理變化更輕微；肺臟切片偶見少量抗酸桿菌；短期存活率達100％。
　　2.重組卡介苗ABX誘導產生抗原特異性的細胞免疫應答：
　　（1）免疫后12周和32周，與BCG組比較，ABX組產生較高水平的Ag85A、Ag85B和HspX特異性TNF-α、IFN-γ。在免疫后12周，ABX組產生Ag85B、HspX和PPD特異性IL-2水平高于BCG組（p<

8、0.05）。隨時間延長三種細胞因子分泌量增加。抗原特異性的IL-4的濃度在各組間均低于30pg/mL，且無統(tǒng)計學差異。
　?。?）免疫后12周和32周，ABX疫苗組抗原特異性CD4+T細胞中分泌IFN-γ和TNF-α的細胞總數比BCG組顯著增加，IL-2細胞總數隨免疫時間延長，顯著升高。進一步分析多功能CD4+T細胞數量，ABX疫苗組誘導產生抗原特異性的TNF-α+、IFN-γ+、IL-2+單陽細胞及TNF-α+-IFN-γ+雙陽

9、細胞最為顯著，均不同程度高于BCG組（p<0.05）。同時，Ag85A特異性的三陽，Ag85B特異性的IFN-γ+-IL-2+雙陽細胞也均顯著高于BCG組（p<0.05）。
　　（3）免疫后12周和32周，ABX組靶向Ag85B的特異性殺傷率分別為28.8％和30.7％，分別顯著高于BCG組的9.64％和8.47％（p<0.05）。
　　3.重組卡介苗ABX維持較高免疫記憶水平：Ag85A、Ag85B、HspX的CD4抗原肽

10、刺激，ABX組在免疫后12周和32周特異性TCM、TEM細胞數均高于BCG組，并且以TEM細胞為主（p<0.05）。Ag85B的CD8抗原肽刺激，ABX疫苗組以TCM細胞較多。分泌IL-2、IFN-γ的記憶細胞隨時間延長，細胞數增加。
　　4.重組卡介苗ABX誘導產生高水平的特異性抗體：與BCG免疫小鼠比較，ABX免疫小鼠32周產生較高水平Ag85A、Ag85B和HspX特異性抗體，尤其以IgG2a最顯著（p<0.05），且明顯高

11、于免疫后12周水平（p<0.05）。ABX疫苗組IgG2a:IgG1比值大于1，隨時間延長，更趨向于Th1型免疫應答。
　　結論:“雞尾酒”重組卡介苗ABX免疫對急性攻毒感染小鼠具有很強的免疫保護性，其保護性有賴于能誘導穩(wěn)定、持久的與過表達抗原相關的特異性CD4+Th1型細胞免疫應答，主要產生以TNF-α+、IFN-γ+、IL-2+單陽細胞及TNF-α+-IFN-γ+雙陽為特征的CD4+多功能T細胞，并增強了CD8+T細胞的特異性