1、目的：
　　本課題擬通過Real time-PCR、基因轉(zhuǎn)染、熒光素酶系統(tǒng)驗證、基因芯片等分子生物學(xué)手段，探尋miR-449b在結(jié)腸癌干細胞中的差異表達和變化，并通過生物信息學(xué)方法挖掘和確證其相應(yīng)的靶基因，建立結(jié)腸癌干細胞生物發(fā)育的特異信號調(diào)控通路。通過這些方面的深入研究，有助于揭示結(jié)腸癌干細胞發(fā)生發(fā)育學(xué)的microRNA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機制，為大腸癌防治提供新的治療靶點和策略。
　　方法：
　　(1)首先進行結(jié)腸癌干細胞

2、的分選和鑒定。根據(jù)目前公認的結(jié)腸癌干細胞表面分選標(biāo)志CD133分子和CD44分子，通過流式細胞儀分離篩選結(jié)腸癌細胞株中CD133+CD44+雙陽性腫瘤干細胞和CD133-CD44-雙陰性細胞。采用流式細胞術(shù)、Western-blot等方法，對結(jié)腸癌腫瘤干細胞的特性進行鑒定。(2)microRNA在結(jié)腸癌干細胞中的差異表達確證。對分離的結(jié)腸癌干細胞進行擴增:無血清培養(yǎng)技術(shù)擴增獲取結(jié)腸癌干細胞。對兩組CD133+CD44+雙陽性腫瘤干細胞和

3、CD133-CD44-雙陰性細胞的總RNA的提取。并利用microRNA芯片比較CD133+CD44+雙陽性腫瘤干細胞和CD133-CD44-雙陰性細胞的microRNA表達譜。挑選出有意義的差異表達的microRNA。(3)綜合mRNA數(shù)據(jù)庫、microRNA數(shù)據(jù)庫、生物信息學(xué)技術(shù)分析預(yù)測候選miR-449b的靶基因mRNA。利用基因芯片比較CD133+CD44+雙陽性腫瘤干細胞和CD133-CD44-雙陰性細胞的mRNA表達譜。對差

4、異基因數(shù)據(jù)進行基因本體論（GeneOntology，GO）分析、信號通路(Pathway)分析、Path-Net的構(gòu)建、動態(tài)基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(Dynamic-Gene-Net)的構(gòu)建。對差異microRNA進行STC分析、GO分析、Pathway分析、Path-Net的構(gòu)建。差異microRNA進行靶基因的預(yù)測，預(yù)測靶基因的數(shù)據(jù)庫:TargetScan。差異microRNA預(yù)測的靶基因與差異基因取交集，microRNA和靶基因的負相關(guān)分析。

5、(4)利用pMIR-REPORTTM microRNA表達熒光素酶(luciferase)報告系統(tǒng)驗證差異表達的microRNA:靶mRNAs相互作用靶位點。(5)利用microRNA抑制劑及pre-microRNA、表達載體轉(zhuǎn)染，進行microRNA分子功能的阻斷和/或再現(xiàn)，研究結(jié)腸癌干細胞差異表達microRNA--CCND1、E2F3通路分子的表型改變，解析差異表達microRNA--CCND1、E2F3通路調(diào)控結(jié)腸癌干細胞的增殖

6、分化功能。
　　結(jié)果：
　　(1)我們通過使用公認的結(jié)腸癌干細胞表面分選標(biāo)志CD133分子CD44分子篩選出結(jié)腸癌細胞株中CD133+和CD44+雙陽性腫瘤干細胞和CD133-和CD44-雙陰性細胞。對腫瘤干細胞在無血清培養(yǎng)擴增后的表面分子CD133和CD44進行了驗證，發(fā)現(xiàn)我們分選的結(jié)腸癌干細胞表面CD133和CD44分布集中、表達水平高，我們對于細胞的公認的干性表達指標(biāo)Bmi1和Oct4進行了確證，發(fā)現(xiàn)在我們分選的結(jié)腸癌

7、干細胞中Bmi1和Oct4的表達水平顯著增高(p＜0.05)。(2)我們通過microRNA和mRNA表達譜芯片比較CD133+和CD44+雙陽性腫瘤干細胞和CD133-和CD44-雙陰性細胞的microRNA表達譜和mRNA表達譜，我們發(fā)現(xiàn)各有31個microRNA的表達值顯著升高和顯著降低，各有14個mRNA的表達值升高10倍以上或值降低10倍以上。并且確證了差異表達的miR-449b、miR-29a、miR-29b等的表達水平(p

8、＜0.05)，確證了差異表達的基因NRAS、FOS、WASF2、COL5A1、CDK6、CCND1等的表達水平(p＜0.05)。(3)使用人類基因數(shù)據(jù)庫、microRNA數(shù)據(jù)庫、生物信息學(xué)技術(shù)（KEGG等）分析，通過計算機分析發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌干細胞與非干細胞中有mi-29a、miR-29b、miR-4524、miR-449b和miR-31等處于關(guān)鍵的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)樞紐性地位(p＜0.05)。并且建立了差異microRNA與差異表達mRNA之間的G

9、O分析、Pathway分析、Path-Net圖。(4)根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果，我們使用熒光素酶報告系統(tǒng)驗證了miR449b與CCND1和E2F3之間的相互作用的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)只有在miR-449b與CCND1和E2F3的非突變體的實驗組中，熒光值下降明顯（p分別為0.019和0.013）。(5)驗證了miR-449b通過作用于CCND1和E2F3靶點，調(diào)節(jié)結(jié)腸癌干細胞自我更新的功能，我們使用MTT實驗測定miR-449b對結(jié)腸癌干細胞

10、自我更新能力的調(diào)控能力。我們發(fā)現(xiàn)在miR-449b高表達組，結(jié)腸癌干細胞的MTT值明顯下降(p=0.010)。我們使用流式細胞儀檢測細胞周期的改變，我們發(fā)現(xiàn)在miR-449b高表達組停滯在細胞周期的G0-G1階段的細胞數(shù)目增加，處于S期的細胞數(shù)目減少。我們檢測與CCND1和E2F3相關(guān)的細胞周期相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)P53和CDK4在miR-449b高表達組分別表現(xiàn)為增高和降低，在miR-449b低表達組有相反表達趨勢?？偟膩碚f，miR-449

11、b通過抑制CCND1和E2F3基因的表達對結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展起著抑癌基因的作用。
　　結(jié)論：
　　(1)miR-449b在結(jié)腸癌干細胞系內(nèi)的表達水平下調(diào)，這一實驗結(jié)果之前罕有文獻報道。(2)繪制了結(jié)腸癌干細胞差異表達microRNA與靶基因關(guān)系圖，提示了結(jié)腸癌干細胞中包括細胞周期，能量代謝，細胞膜連接等多種功能表達相關(guān)的差異。(3)miR-449b對結(jié)腸癌干細胞的自我更新起到抑制作用，提示miR-449b分子在結(jié)腸癌發(fā)病中起著