1、腦膠質瘤是一類惡性程度較高，具有高侵襲性，高復發(fā)率及高致死率的疾病。近年來，雖然膠質瘤的診斷治療得到不斷的增強。但其患者的預后仍未得到明顯的改善。近年來，人們對膠質瘤的發(fā)病機制闡述逐漸深入發(fā)現(xiàn)，大部分膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中，RB，PI3K，P53這3條通路的異常改變參與其中。因此，尋找該調控網絡關鍵調控分子，抑制膠質瘤的形成與發(fā)展，從而為臨床提供準確有效的治療靶標，目前已成為了神經外科領域所關注的熱點問題。
　　 RTN4是網狀蛋白

2、家族的成員之一，包含三個剪切變體:RTN4A，RTN4B，RTN4C，每個剪切變體在不同的細胞中發(fā)揮不同的生物學功能，廣泛地參與了細胞分化成熟，增殖，凋亡，遷移，粘附，侵襲等各項功能的調控。既往研究認為，RTN4在膠質瘤中屬于腫瘤抑制基因，其剪切變體RTN4A，RTN4B，RTN4C均有報道在細胞生長中起抑制作用，但目前有實驗證實，RTN4A在膠質瘤中普遍存在表達，部分甚至存在過表達。作為腫瘤抑制基因，為何會在膠質瘤中過表達，其對腫瘤發(fā)

3、生發(fā)展的功能影響及意義仍不為人知?；仡櫸墨I，目前關于RTN4及膠質瘤惡性生物學行為如增殖凋亡，侵襲遷移方面的研究較少。因此本實驗擬從組織水平、細胞水平和動物水平，通過定量RT-PCR、慢病毒RNA干擾，MTT增殖曲線，克隆形成，細胞周期等方法，研究RTN4及其剪切變體調節(jié)腦膠質瘤惡性生物學特性的病理機制。
　　 第一部分:RTN4在腦膠質瘤組織和細胞系中的表達及與病理類型的關系
　　 目的:RTN4是網狀蛋白家族的成員之

4、一，其廣泛地參與了細胞的各種生物學行為的調控過程。但是目前，關于RTN4在膠質瘤中的表達情況仍不為人知。本部分利用實時定量RT-PCR的方法，研究RTN4在腦膠質瘤組織和U251，U87，U373，A172細胞系中的表達，并探索RTN4表達量與膠質瘤病理類型的相關性。
　　 方法:1）收集病理證實（參照2007 WHO中樞神經系統(tǒng)腫瘤診斷分類標準）為膠質瘤的臨床液氮凍存標本10例（Ⅰ級1例，Ⅱ級2例，Ⅲ級3例，Ⅳ級4例），采用實

5、時定量RT-PCR方法檢測各例標本中RTN4 mRNA的表達量，分析其與病理級別及組織類型的相關性。2）利用實時定量RT-PCR檢測RTN4 mRNA在A172，U373，U251和U87膠質瘤細胞株中的表達，比較膠質瘤細胞系中RTN4的表達變化。
　　 結果:在膠質瘤標本中，RTN4表達普遍存在，部分標本中，RTN4呈現(xiàn)明顯的過表達。通過半定量RT-PCR方法，與內參β-actin蛋白比較，3例低級別膠質瘤平均表達水平為1.7

6、6±1.44，7例高級別膠質瘤平均表達水平為2.34±2.53。RTN4在高低級別膠質瘤中的表達無明顯統(tǒng)計學差異。少突膠質瘤細胞(4.67±4.75)與星形膠質瘤細胞（1.54±0.85）之間的RTN4表達差異存在統(tǒng)計學意義。在四組膠質瘤細胞系中，RTN4亦存在表達，但四組膠質瘤細胞系間RTN4表達具有明顯差異(P＜0.05)，兩兩細胞系之間的RTN4表達均不相同。
　　 結論:在膠質瘤標本及細胞系中，均存在RTN4表達，部分標

7、本或細胞系中，RTN4存在明顯過表達。RTN4表達與膠質瘤病理等級無明顯關聯(lián)。然而在膠質瘤的組織類型上存在差異。作為腫瘤抑制因子，其在腫瘤中的表達增加的意義和作用以及其在腫瘤組織類型上的鑒別意義有待我們繼續(xù)研究證實。
　　 第二部分:構建靶向RTN4的干擾shRNA慢病毒載體
　　 目的:前期實驗我們證實，RTN4在膠質瘤組織標本及細胞系中存在不同程度的表達，部分過表達，然而，一個抑癌基因其在腫瘤中高表達的作用仍是未知。

8、為了探尋RTN4在膠質瘤中的作用，我們擬先建立shRNA穩(wěn)定干擾RTN4表達病毒載體。
　　 方法:1）利用shRNA設計軟件，選取合適的shRNA序列，采用基因重組技術插入質粒。將質粒轉化入細胞表達擴增。2）對建立的shRNA質粒進行測序，并且將其轉染U251細胞系，通過RT-PCR觀察其對RTN4表達的抑制情況
　　 結果:根據siRNA設計原則，設計shRNA序列及shCON序列，成功將其插入pGPU6/GFP/N

9、eo質粒中。將其轉染膠質瘤細胞U251細胞系后測序證實RNA干擾質粒中shRNA干擾序列與設計一致。RT-PCR實驗證實，轉染shRNA的U251細胞與轉染shCON的細胞相比，RTN4 mRNA的表達明顯下降(P＜0.05)。
　　 結論:在本實驗中成功地構建了可穩(wěn)定干擾RTN4 mRNA表達的慢病毒載體。
　　 第三部分:RTN4調控膠質瘤細胞惡性生物學行為的實驗研究
　　 目的:RTN4廣泛參與多種細胞生物

10、學行為的調控過程。前期實驗證實RTN4在膠質瘤中呈現(xiàn)過表達。但其在膠質瘤中具體發(fā)揮的功能仍是未知。本部分采用穩(wěn)定改變內源性RTN4表達水平的RNA干擾慢病毒載體，研究RTN4對于腦膠質瘤惡性生物學行為的作用。
　　 方法:靶向RTN4穩(wěn)定RNA干擾載體轉染膠質瘤U251、U87及U373細胞，采用RT-PCR驗證干擾的有效性。采用MTT法檢測細胞生長曲線變化，克隆形成實驗檢測細胞的克隆形成能力改變，通過流式細胞技術檢測細胞周期的

11、變化。繼而通過WesternBlot實驗檢測RTN4可能調控的下游分子的表達變化。
　　 結果:使用shRNA干擾膠質瘤細胞內的RTN4 mRNA表達，U251，U87及U373膠質瘤細胞的增殖能力下降，克隆形成能力減弱。細胞周期實驗發(fā)現(xiàn)，RTN4表達下降后，U251細胞的細胞周期被阻斷于G0/G1期，進入分裂期的細胞數明顯減少。Western Blot檢測9種細胞周期相關蛋白發(fā)現(xiàn)，RTN4下調伴隨著CDK4及CDC25A的下調