1、髓母細胞瘤是兒童最常見的惡性腦腫瘤，約占兒童全部腦腫瘤的20％。近年來雖然通過改良手術(shù)技術(shù)，放療及化療策略在治療上取得了很大的進步，但患兒預后仍然不是很理想。髓母細胞瘤目前最主要的治療方法是手術(shù)，配合放化療。但由于腫瘤惡性程度高，生長迅速，就診時往往腫瘤巨大并有腦積水，而且患者多為年齡較小的兒童，手術(shù)風險大。髓母細胞瘤屬于對放療敏感的腫瘤，但腫瘤細胞易隨腦脊液播散，故放射治療時要做全腦全脊髓放療，放療劑量大，對兒童損傷大?；熥鳛橐环N輔

2、助的手段，對兒童毒、副作用嚴重。髓母細胞瘤預后極差。
　　 基因療法是近年來興起的新治療手段，具有非常廣闊的前景。然而，由于基因轉(zhuǎn)染靶細胞效率低等原因，基因治療目前難以取得很好的療效。增強“旁觀者效應”(bystander effect，BE)可以為我們提供了一個更好的途徑來解決這個問題?！芭杂^者效應”是指加入前藥后，與導入自殺基因的腫瘤細胞相鄰近的未導入自殺基因的腫瘤細胞也被殺死的現(xiàn)象，其明顯擴大了自殺基因的殺傷作用。目前許多

3、報道認為旁觀者效應與連接素43(Cx43)和細胞間縫隙連接通訊(GJIC)有關。
　　 Cx43是一種主要的細胞間隙連接蛋白，在多種正常組織細胞中表達。Cx43表達減少或缺失與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關，特別是與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展關系極為密切。相鄰細胞間通過間隙連接所介導的間隙連接通訊(GJIC)進行細胞間信息和能量交換，對細胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化起著重要的調(diào)控作用。在多種腫瘤組織中GJIC功能明顯下降。

4、r>　　 增加Cx43蛋白表達和GJIC功能能夠增強旁觀者效應。相對于基因轉(zhuǎn)染，化學誘導的Cx43蛋白增加可以影響到更多的癌細胞。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多種類的化學藥物諸如類視黃醇、cAMP、類胡蘿卜素等都可以增加細胞Cx43的表達量，增強GJIC功能。另有研究發(fā)現(xiàn)將Cx43轉(zhuǎn)染進惡性膠質(zhì)瘤細胞后，隨著Cx43蛋白表達的增加，細胞對化療藥物的敏感性也增加了。因此，找到某種化學物質(zhì)能夠提高旁觀者效應又能提高細胞對化療藥物的敏感性對于髓母細胞瘤的

5、治療是非常有意義的。
　　 在本研究中，我們用含有HSV-tk基因的小鼠成纖維細胞株PA317病毒上清轉(zhuǎn)染人髓母細胞瘤Daoy細胞，構(gòu)建HSV-tk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)。然后以db-cAMP處理Daoy細胞，通過Western Blot檢測Cx43蛋白表達，以劃痕標記染料示蹤實驗(scrape-loading and dye transfer，SLDT)檢測了GJIC功能，以MTT法檢查了旁觀者效應及細胞對化療藥物替莫唑胺(

6、temozolomide，TMZ)和替尼泊苷(teniposide，VM-26)的敏感性。為探討機理，又用Western Blot檢測Bcl-2蛋白表達。通過棉子酚的反向作用探討了db-cAMP的具體作用機制。
　　 材料與方法：
　　 1、人髓母細胞瘤Daoy細胞和PA317細胞的培養(yǎng)
　　 含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃，濕度100%，5%CO2條件的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一周傳代兩次。

7、　　 2、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染Daoy細胞
　　 將PA317細胞接種在75cm2培養(yǎng)瓶中，高糖DMEM加10%滅活FCS培養(yǎng)。接種24-48h后，收集上清液，濾過后儲存于-80℃?zhèn)溆?。然后以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染Daoy細胞。首先，將一百萬傳代Daoy細胞接種在75cm2培養(yǎng)皿中，24h后，將儲存的含有病毒載體的細胞上清液加入終濃度為4μg/ml Polybrene，再加入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h。處理后的細胞以150μg/ml G41

8、8篩選兩周，用間接免疫熒光法檢測轉(zhuǎn)染效率。G418篩選處理后的細胞，兩周后得到穩(wěn)定細胞株Daoy-tk。
　　 3、用間接免疫熒光法檢測HSV-tk基因在Daoy細胞中的轉(zhuǎn)染效率。
　　 4、用RT-PCR法檢測HSV-tk基因是否存在，判斷是否基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進Daoy細胞中。
　　 5、用MTT法檢測db-cAMP和GCV對Daoy細胞存活率是否有協(xié)調(diào)作用。
　　 6、用Western blot法檢測Bc

9、l-2蛋白在db-cAMP處理組和未處理組中的變化。檢測了Cx43蛋白單用db-cAMP處理組；和先用db-cAMP，后用棉子酚處理組：db-cAMP未處理組中的變化。
　　 7、用劃痕標記染料示蹤實驗檢測不同處理組細胞的GJIC功能的變化
　　 8、用MTT法檢測不同處理組的旁觀者效應的變化。
　　 9、用MTT法檢測db-cAMP處理組和未處理組中的細胞對替莫唑胺和替尼泊苷敏感性的變化。
　　 結(jié)果：

10、
　　 1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染Daoy細胞成功，獲得穩(wěn)定的Daoy-tk細胞株。
　　 2、間接免疫熒光實驗顯示轉(zhuǎn)染含HSV-tk基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體于Daoy細胞后，轉(zhuǎn)染效果較好，Daoy-tk細胞在視野清晰可見。
　　 3、通過RT-PCR方法驗證，HSV-tk基因在Daoy細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
　　 4、db-cAMP處理與未經(jīng)db-cAMP處理的Daoy細胞相比較，無論是處理24小時或是72小時，給予G

11、CV處理后兩者存活率無顯著性差別。
　　 5、db-cAMP(0.5mM)以濃度依賴性方式顯著增加Cx43蛋白及磷酸化形式蛋白的表達。當db-cAMP濃度為0.5mM時，細胞中Cx43蛋白表達量相對于對照細胞增加了近2倍；當db-cAMP濃度增加為1mM和1.5mM時，Cx43蛋白表達量增加了近3倍。經(jīng)db-cAMP處理的Daoy細胞Bcl-2蛋白表達量相對于正常細胞顯著降低。
　　 6、db-cAMP可以顯著增強Dao

12、y細胞GJIC功能，隨著培養(yǎng)時間增加，瑩黃在經(jīng)db-cAMP處理的細胞中彌散的速度快于其他兩組細胞，差距隨時間增大。
　　 7、在tk+/tk-細胞比率為20:1-2-5:1時，經(jīng)db-cAMP處理組細胞較對照組細胞生存率顯著降低；當k+/tk-細胞比率降至2-5:1，處理組中仍可以觀察到比較明顯的旁觀者效應，但在未經(jīng)db-cAMP處理細胞中，比率升至2-2:1時才可以觀察到比較明顯的旁觀者效應。
　　 8、db-cAM

13、P可以明顯增強TMZ和VM26兩種化療藥物對Daoy細胞的細胞毒性。Daoy細胞經(jīng)db-cAMP處理后，TMZ和VM26兩種藥物IC50值顯著降低；與未處理對照細胞相比，db-cAMP處理的TMZ細胞毒性是對照細胞的3倍，VM26是對照細胞的2倍。
　　 結(jié)論：
　　 1、在人髓母細胞瘤Daoy細胞中成功轉(zhuǎn)入HSV-tk基因，形成穩(wěn)定Daoy-tk細胞株。經(jīng)免疫熒光法檢測和RT-PCR實驗，證實了Daoy-tk細胞株中t

14、k基因的存在。
　　 2、db-cAMP能明顯增強Daoy細胞中自殺基因治療的旁觀者效應，棉子酚可對抗此增強效應。
　　 3、db-cAMP是強力分化誘導子，具有抗增值的效果，GCV是基因治療中的“前藥”，二者對Daoy細胞無協(xié)同作用。
　　 4、db-cAMP顯著上調(diào)Cx43蛋白及磷酸化Cx43蛋白的表達，而棉子酚顯著下調(diào)Cx43蛋白及磷酸化Cx43蛋白。
　　 5、db-cAMP顯著增強GJIC功能，