1、背景與目的:
　　卵巢癌是世界范圍內(nèi)最致命的婦科惡性疾病之一，由于缺乏典型的臨床癥狀、特異的體征及腫瘤標(biāo)志物等有效的篩查手段，絕大多數(shù)卵巢癌病人在得到診斷時(shí)已處于晚期，使其死亡率高居?jì)D科惡性腫瘤首位。腫瘤的轉(zhuǎn)移能力有賴于細(xì)胞的遷移與侵襲，然而決定腫瘤轉(zhuǎn)移能力的分子機(jī)制目前仍然不十分清楚。因此，努力探索調(diào)控卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的分子靶標(biāo)將至關(guān)重要。Hedgehog(Hh)信號通路在細(xì)胞命運(yùn)決定以及細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用。該通路由H

2、h配體，膜受體Ptch和跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smo以及參與Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的胞漿蛋白復(fù)合體組成，其級聯(lián)傳導(dǎo)的末點(diǎn)被公認(rèn)為鋅指轉(zhuǎn)錄因子Gli(Glioma-associated oncogenetranscription factors)，是該信號通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起樞紐作用。Hh靶基因涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期以及干細(xì)胞形成和細(xì)胞侵襲等多方面。有研究發(fā)現(xiàn):卵巢癌中Hedgehog(Hh)信號通路異?；罨?，但信號通路異常

3、活化與卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系有待進(jìn)一步明晰。本研究試圖發(fā)現(xiàn)受Hh信號通路調(diào)控的靶基因，從臨床標(biāo)本、細(xì)胞及分子水平、動物模型等多個(gè)層次，采用細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科手段闡明受Hh信號通路調(diào)控的靶基因的作用及分子機(jī)制，進(jìn)一步揭示Hh信號通路與卵巢癌侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為卵巢癌診療策略的選擇及抗癌新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　第一部分人上皮性卵巢癌組織中Hedgehog信號通路異?；罨c臨床病理特征

4、的關(guān)系
　　(1)為了證實(shí)在卵巢癌中存在Hh信號通路的異?；罨?，我們采用免疫組化技術(shù)檢測了65例卵巢癌病人卵巢腫瘤組織石蠟切片中Hh信號通路重要組分蛋白Gli2的表達(dá)情況，并且在此基礎(chǔ)上將Gli2的表達(dá)情況與卵巢癌的臨床病理特征進(jìn)行了相關(guān)性分析。
　　(2)同時(shí)，通過Western-blot及real-time PCR等方法檢測卵巢癌及正常卵巢組織中Hh信號通路重要組分蛋白Shh、Gli1、Gli2等的蛋白水平及mRNA水平

5、的表達(dá)情況。
　　第二部分抑制Hedgehog信號通路降低卵巢癌細(xì)胞增殖與遷移能力
　　(1)為了探索Hh信號通路與卵巢癌細(xì)胞增殖與遷移能力的關(guān)系，我們以卵巢癌細(xì)胞系（SKO-V3和ES-2）為研究對象，采用轉(zhuǎn)錄因子Gli特異性小分子抑制劑GANT61處理SKO-V3和ES-2細(xì)胞，對加藥處理（實(shí)驗(yàn)組加30μMGANT61，對照組加等體積的DMSO）的SKO-V3和ES-2細(xì)胞通過Western-blot、real-time

6、 PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)方法在蛋白水平以及mRNA水平檢測了Hh信號通路中相關(guān)組分，如跨膜受體Smo，終末轉(zhuǎn)錄因子Gli1和Gli2的表達(dá)情況。
　　(2)加藥處理（實(shí)驗(yàn)組加30μM GANT61，對照組加等體積的DMSO）后的SKO-V3和ES-2細(xì)胞，分別通過MTT比色法及BrdU增殖實(shí)驗(yàn)檢測其細(xì)胞活力及增殖能力的變化。
　　(3)加藥處理（實(shí)驗(yàn)組加30μM GANT61，對照組加等體積的DMSO）后的ES-2細(xì)胞，通過細(xì)

7、胞劃痕實(shí)驗(yàn)及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測其細(xì)胞遷移及克隆形成能力的變化。
　　第三部分抑制Hedgehog信號通路改變卵巢癌細(xì)胞基因表達(dá)譜
　　(1)為了研究抑制Hh信號通路對卵巢癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，采用轉(zhuǎn)錄因子Gli特異性小分子抑制劑GANT61(實(shí)驗(yàn)組加30μM GANT61，對照組加等體積的DMSO)，處理SKO-V3和ES-2細(xì)胞60 hr，采用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)分析其受Gli調(diào)控的差異表達(dá)基因，并對差異表達(dá)的基因進(jìn)行

8、GO(gene ontology)pathway分析和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes) pathway分析，發(fā)現(xiàn)受Hh信號通路調(diào)控的靶基因。并采用real-time PCR和Western blot分別對芯片發(fā)現(xiàn)的富集于某些信號通路的差異基因以及相關(guān)基因（如ITGB4、FAK、CD24、MMP7等）在mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)芯片結(jié)果的可靠性。
　　(2)用Gl

9、i特異性小分子抑制劑GANT61，轉(zhuǎn)錄因子Gli的siRNA(miR-Gli1)和含Hh配體的條件培養(yǎng)液(Shh-Med)分別抑制或激活Hh信號通路，采用real-time PCR、Western blot以及細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)研究Hh信號通路調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　第四部分抑制Hedgehog信號通路減慢卵巢癌生長
　　為了在體內(nèi)水平研究Hh信號通路對卵巢癌生長的影響，我們采用卵巢癌組織塊皮下移植法構(gòu)建荷人卵

10、巢癌裸鼠皮下移植瘤模型;并利用此動物模型，給予GANT61（濃度10mg/ml，0.2ml/次）和同體積的溶劑對照處理，觀測卵巢癌體積的變化，比較瘤體重量的改變;同時(shí)采用Western blot技術(shù)檢測瘤組織中Gli1和Gli2的表達(dá)水平的變化，免疫組化技術(shù)檢測瘤體中整合素integrinβ4(ITGB4)和磷酸化的粘著斑激酶(p-FAK)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分人上皮性卵巢癌組織中Hedgehog信號通路異常

11、活化與臨床病理特征的關(guān)系
　　(1)人卵巢癌組織標(biāo)本行Western blot檢測及real-time PCR檢測，發(fā)現(xiàn)其Shh，Gli1和Gli2蛋白表達(dá)水平明顯高于正常卵巢組織;Shh，Gli1和Gli2 mRNA水平明顯高于正常卵巢組織，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)提示:卵巢癌組織中Hh信號通路異常活化。
　　(2)人卵巢癌組織標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色提示:Gli2的蛋白表達(dá)水平與卵巢癌患者的臨床病理分期相關(guān)，其

12、中晚期（Ⅲ-ⅣV期）的卵巢癌患者的Gli2蛋白的高評分發(fā)生率明顯高于早期（Ⅰ-Ⅱ期）的卵巢癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);與卵巢癌患者的年齡、病理組織學(xué)類型、分化程度及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　第二部分抑制Hedgehog信號通路降低卵巢癌細(xì)胞增殖與遷移能力
　　(1)Gli特異性小分子抑制劑GANT61降低ES-2和SKO-V3細(xì)胞的Gli1及Gli2蛋白表達(dá)水平;GA

13、NT61降低ES-2和SKO-V3細(xì)胞的Gli1和Gli2的mRNA表達(dá)水平，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);經(jīng)GANT61處理后細(xì)胞免疫熒光顯示:Gli1蛋白表達(dá)水平顯著降低。
　　(2)Gli表達(dá)下調(diào)可直接抑制卵巢癌細(xì)胞活力，（MTT法;p＜0.01）;降低其增殖活性，(BrdU法;p＜0.01)。
　　(3)GANT61抑制卵巢癌細(xì)胞(ES-2)的遷移能力，（劃痕實(shí)驗(yàn);p＜O.05）;GANT61抑制卵巢癌細(xì)胞

14、(ES-2)的克隆形成能力，（軟瓊脂法;p＜0.01）。
　　第三部分抑制Hedgehog信號通路改變卵巢癌細(xì)胞基因表達(dá)譜
　　(1)基因芯片表達(dá)譜及通路網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示:SKO-V3細(xì)胞經(jīng)GANT61處理60 hr后的差異表達(dá)基因的通路網(wǎng)絡(luò)中，主要影響細(xì)胞粘附相關(guān)信號通路為主，既有部分表現(xiàn)為上調(diào)，同時(shí)也有部分表現(xiàn)為下調(diào)，其中以整合素蛋白integrins與骨架蛋白lamin為主。同時(shí)，MAPK信號通路也有明顯的差異基因的富

15、集，而該通路中差異表達(dá)基因絕大多數(shù)表現(xiàn)為上調(diào)，僅少數(shù)幾個(gè)表現(xiàn)為下調(diào)。
　　(2)采用real-time PCR和Western blot在mRNA以及蛋白水平驗(yàn)證芯片結(jié)果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)GANT61處理的SKO-V3細(xì)胞，ITGB4，COL1A1，COL5A1等基因mRNA水平表達(dá)明顯下降，(p＜0.01);而LAMC2，ITGA5，LAMA3等基因mRNA水平表達(dá)明顯升高，(p＜0.01)，與Microarray所獲結(jié)果一致。此外，CD

16、24，CD70，S100A2及MMP7等mRNA表達(dá)水平下降，(p＜0.01);而S100A4和FAK mRNA水平無顯著差異，(p＞0.05)，與Microarray所獲結(jié)果基本一致;Western blot結(jié)果顯示:GANT61處理的SKO-V3細(xì)胞，ITGB4，CD24，MMP7等蛋白表達(dá)水平明顯下降，(p＜0.01);而FAK蛋白表達(dá)水平改變不明顯，(p＞0.05)，與real-time PCR結(jié)果基本一致。
　　(3)采

17、用Shh配體條件培養(yǎng)液(Shh-Med)激活Hh信號通路，觀察上述差異基因的表達(dá)變化，結(jié)果提示:Shh配體條件培養(yǎng)液(Shh-Med)處理SKO-V3細(xì)胞后，ITGB4的蛋白表達(dá)水平以及mRNA表達(dá)水平明顯增加，(p＜0.01)。此外，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)提示:Shh-Med刺激Hh信號通路所引起的SKO-V3細(xì)胞侵襲能力的增加可以被抗ITGB4抗體(anti-ITGB4)所阻斷(p＜0.01)。
　　(4)為了證實(shí)GANT61對轉(zhuǎn)錄因子

18、Gli作用的特異性，我們采用Gli1特異的siRNA(miR-Gli1-720)干擾Gli1的表達(dá)，Western blot結(jié)果顯示:miR-Gli1-720轉(zhuǎn)染的SKO-V3細(xì)胞中Gli1及ITGB4的蛋白表達(dá)水平明顯下降，與GANT61的抑制效果一致。
　　(5)有文獻(xiàn)報(bào)道ITGB4可調(diào)控FAK信號，為了闡明Hh信號通路影響ITGB4表達(dá)的生物學(xué)意義，我們采用Shh-Med和GANT61分別處理SKO-V3細(xì)胞，結(jié)果提示: S

19、hh-Med處理SKO-V3細(xì)胞后，F(xiàn)AK的蛋白表達(dá)水平未明顯改變，而磷酸化的FAK(p-FAK)水平明顯增加，(p＜0.01); GANT61處理SKO-V3細(xì)胞后，F(xiàn)AK的蛋白表達(dá)水平未見明顯改變，而p-FAK水平明顯下降，(p＜0.01)，另一方面，Western blot結(jié)果顯示:Hh信號通路激活所引起的SKO-V3細(xì)胞p-FAK水平的增加可以被anti-ITGB4所阻斷。提示Hh信號通路激活可通過ITGB4介導(dǎo)促進(jìn)FAK蛋白磷

20、酸化。
　　(6)此外，我們采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察抑制Hh信號通路對FAK磷酸化及細(xì)胞骨架的影響，結(jié)果顯示:經(jīng)GANT61處的SKO-V3細(xì)胞p-FAK-Y397的表達(dá)水平明顯下降，提示:抑制Hh信號通路可影響FAK的活化;同時(shí)，經(jīng)GANT61處理后，SKO-V3細(xì)胞骨架發(fā)生破壞，細(xì)胞偽足明顯減少，提示:抑制Hh信號通路可影響SKO-V3細(xì)胞的侵襲能力。
　　第四部分抑制Hedgehog信號通路減慢卵巢癌生長
　　(

21、1)為了在體內(nèi)水平研究Hh信號通路對卵巢癌細(xì)胞生長的影響，我們成功采用瘤組織塊皮下移植法構(gòu)建荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型。
　　(2)實(shí)驗(yàn)組（GANT61組）比對照組（溶劑組）裸鼠腫瘤生長速度明顯下降，尤其是在給藥4次后，對照組腫瘤體積增長迅速，而實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積緩慢增長。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)將兩組裸鼠皮下移植瘤離體后稱重，實(shí)驗(yàn)組瘤體重量明顯低于對照組，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　(3)Western blot結(jié)果顯示

22、:實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下移植瘤中Gli1和Gli2蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組裸鼠，相對定量結(jié)果提示差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(p＜0.01);免疫組織化學(xué)法檢測實(shí)驗(yàn)組裸鼠及對照組裸鼠皮下移植瘤中ITGB4及p-FAK的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組相比對照組瘤體中ITGB4及p-FAK的蛋白表達(dá)水平明顯下降。
　　結(jié)論:
　　1、卵巢癌組織中Hh信號通路異?；罨?，Hh信號通路重要組分蛋白Gli2的表達(dá)水平與卵巢癌的臨床病理分期密切相關(guān)。

23、
　　2、GANT61降低卵巢癌細(xì)胞(ES-2和SKO-V3)的Gli1和Gli2表達(dá)水平，同時(shí)，抑制ES-2和SKO-V3細(xì)胞的活力、增殖、遷移及克隆形成能力。
　　3、采用Gli特異性小分子抑制劑GANT61處理SKO-V3細(xì)胞，通過基因芯片表達(dá)譜分析篩選出差異表達(dá)基因，并且選擇部分與細(xì)胞粘附及遷移密切相關(guān)的基因進(jìn)行蛋白水平及mRNA水平的鑒定，鑒定結(jié)果與芯片分析結(jié)果一致，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Gli的下調(diào)降低ITGB4的表達(dá)，通