1、豬蛔蟲(chóng)（Ascaris suum）是一種寄生線(xiàn)蟲(chóng)，在分類(lèi)上隸屬線(xiàn)蟲(chóng)綱（Nematoda）、蛔目（Ascaridata）、蛔科（Ascaridae）、蛔屬(Ascaris)，在全球廣泛流行，豬群感染率高達(dá)50％～70％。成蟲(chóng)寄生于豬小腸腸腔內(nèi)，在豬體內(nèi)寄生的數(shù)量巨大，可達(dá)1000條以上，常引起腸腔堵塞，擾亂機(jī)體的消化吸收，導(dǎo)致消瘦、出血及生長(zhǎng)不良。據(jù)估計(jì)雌性成蟲(chóng)每天的產(chǎn)卵量可多達(dá)20萬(wàn)到200萬(wàn)個(gè)。豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)在豬體內(nèi)移行會(huì)損傷肺臟和肝臟，

2、并引起其他繼發(fā)性疾病，導(dǎo)致幼齡豬死亡，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。另外豬蛔蟲(chóng)在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)被認(rèn)為和人蛔蟲(chóng)是一個(gè)種，豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)還會(huì)在人體寄生，引起眼幼蟲(chóng)移行癥等。所以，對(duì)豬蛔蟲(chóng)病的研究也具有重要公共衛(wèi)生學(xué)意義。
　　MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性的非編碼小RNA，長(zhǎng)度通常約18～22nt，廣泛存在于真核生物中，具有發(fā)育階段特異性、時(shí)序性或者組織特異性的表達(dá)特點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，寄生線(xiàn)蟲(chóng)可以通

3、過(guò)miRNA實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主和自身基因表達(dá)的精確調(diào)控，提高感染和增殖的能力，逃避免疫監(jiān)視。對(duì)這種機(jī)制的充分了解和把握有助于更好地理解寄生線(xiàn)蟲(chóng)的調(diào)控機(jī)理和性別分化機(jī)制，從而很可能成為免疫預(yù)防或化學(xué)治療的“關(guān)鍵”靶分子。為此，本文分別對(duì)豬蛔蟲(chóng)和人蛔蟲(chóng)成蟲(chóng)期miRNA進(jìn)行深度測(cè)序，并對(duì)兩者的表達(dá)譜比較分析;同樣，對(duì)豬蛔蟲(chóng)不同發(fā)育期miRNA進(jìn)行深度測(cè)序，對(duì)表達(dá)譜進(jìn)行分析比較;最后，選取三個(gè)miRNA(miRNA-36、miRNA-100b、miRN

4、A-81a)為研究對(duì)象，進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能。結(jié)果如下:
　　一、豬蛔蟲(chóng)與人蛔蟲(chóng)成蟲(chóng)期miRNA表達(dá)譜及比較分析
　　采用深度測(cè)序獲得豬蛔蟲(chóng)人蛔蟲(chóng)成蟲(chóng)miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，我們從人蛔蟲(chóng)豬蛔蟲(chóng)成蟲(chóng)樣品中分別獲得了171及494 miRNA候選者。其中74個(gè)miRNA是兩種蛔蟲(chóng)共有的，97和420個(gè)miRNA是人蛔蟲(chóng)豬蛔蟲(chóng)特異的。靶基因及功能注釋分析顯示兩類(lèi)蛔蟲(chóng)的很多靶基因與卵巢信息蛋白，卵黃蛋白原和軟骨素蛋白多糖有關(guān)。富集分

5、析顯示兩種蛔蟲(chóng)的大多數(shù)miRNA靶基因是相似的，但是兩種蛔蟲(chóng)靶基因數(shù)目不同，而某些功能如NADH脫氫酶及電子轉(zhuǎn)運(yùn)功能等是豬蛔蟲(chóng)特有的。豬蛔蟲(chóng)人蛔蟲(chóng)miRNA表達(dá)譜比較研究結(jié)果為豬蛔蟲(chóng)人蛔蟲(chóng)是一個(gè)種提供了一種證據(jù)。
　　二、豬蛔蟲(chóng)不同發(fā)育階段miRNA高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析
　　建立了豬蛔蟲(chóng)7個(gè)不同發(fā)育（包含蟲(chóng)卵，肝階段L3期幼蟲(chóng)，肺階段L3期幼蟲(chóng)，L4期幼蟲(chóng)，L5階段幼蟲(chóng)，成熟雌性成蟲(chóng)，成熟雄性成蟲(chóng)）時(shí)期的文庫(kù)。高通量測(cè)

6、序后共獲得8516852條unique reads。在7個(gè)階段分別共獲得565、215、157、128、174、486和498個(gè)miRNA，其中通過(guò)同源性分析分別有75、95、82、77、79、80和85個(gè)miRNA是已知的，其余都是新miRNA。通過(guò)比對(duì)分析獲得75個(gè)miRNA在7個(gè)發(fā)育階段共同表達(dá)，437個(gè)miRNA在胚胎期特異表達(dá)，還有一些在胚胎期表達(dá)量非常高，如asu-miR-44b和asu-miR-5350a，暗示它們可能與胚

7、胎發(fā)育有關(guān)。165個(gè)miRNA是發(fā)育期特異表達(dá)的，asu-miR-184、asu-miR-5348、asu-miR-5351、asu-miR-5352、asu-miR-5367和asu-miR-72在L3期表達(dá)量特別高，可能與三期幼蟲(chóng)的感染性有關(guān)。還有一些miRNA在兩個(gè)相鄰階段表達(dá)非常高，推測(cè)與發(fā)育期過(guò)渡有關(guān)，如asu-miR-239、asu-miR-279c、asu-miR-5357、asu-miR-5364和prd-let-7可能

8、與幼蟲(chóng)到成蟲(chóng)期過(guò)渡有關(guān)。RNAhybrid預(yù)測(cè)共得到1291個(gè)靶基因，GO分析發(fā)現(xiàn)很多靶基因在豬蛔蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用，如與線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)育及壽命有關(guān)的，胚胎發(fā)育，蛻皮，發(fā)育期過(guò)度，生殖，產(chǎn)卵，遷移，形態(tài)改變等，富集分析顯示預(yù)測(cè)靶基因主要集中在催化及結(jié)合功能，其次是生物進(jìn)程，細(xì)胞進(jìn)程，代謝進(jìn)程，發(fā)育進(jìn)程。選擇3個(gè)卵階段特異表達(dá)的miRNA及5個(gè)所有發(fā)育階段共表達(dá)的miRNA進(jìn)行了熒光定量分析，結(jié)果顯示5個(gè)階段共表達(dá)miRNA的定量結(jié)果與

9、預(yù)測(cè)均相符，卵時(shí)期特異表達(dá)的3個(gè)miRNA與測(cè)序結(jié)果不符。
　　三、豬蛔蟲(chóng)三個(gè)miRNA的功能特征初步研究
　　設(shè)計(jì)合成了3個(gè)miRNA(miRNA-36，miRNA-100a，miRNA-81a)的mimic、inhibitor及相應(yīng)的陰性對(duì)照，通過(guò)浸泡的方式導(dǎo)入蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)體內(nèi)，用熒光定量來(lái)檢測(cè)miRNA及其靶基因的豐度變化。每個(gè)miRNA的功能用豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)的感染率及其從小鼠肝、肺回收的豬蛔蟲(chóng)蟲(chóng)體長(zhǎng)度和寬度來(lái)評(píng)價(jià)。miRNA

10、 mimic浸泡進(jìn)入后的蟲(chóng)體的相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平上升，抑制劑處理蟲(chóng)體的相應(yīng)miRNA的水平下降，表明通過(guò)浸泡可以成功導(dǎo)入miRNA的mimic及inhibitor。miRNA mimic的導(dǎo)入在體內(nèi)不發(fā)揮明顯的功能效果，蟲(chóng)體的感染力生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有明顯變化，表明內(nèi)源miRNA的表達(dá)水平可以維持蟲(chóng)體的正常的發(fā)育。miRNA-36 inhibitor處理組每只小鼠的幼蟲(chóng)感染量為71.40±25.22個(gè)，明顯低于inhibitor陰性對(duì)照（

11、170.89±12.45個(gè)）及空白組(230.30±17.47個(gè))，差異顯著(P＜0.05);inhibitor處理組的蟲(chóng)體長(zhǎng)度為410.57±71.31μm，寬度為16.20±2.43μm，明顯低于陰性對(duì)照組及空白組(P＜0.01)。miRNA-100a inhibitor處理組每只小鼠的平均感染量為42.40±25.22個(gè)，與陰性對(duì)照（140.89±12.45μm）及空白（178.30±17.47μm）相比差異顯著;inhibito