1、中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育涉及包括神經誘導、細胞周期的調控、神經元特異基因的表達和神經前體細胞的分化等多個過程，而這些過程又涉及了居多信號通路以及相關基因表達產物的相互作用?？偟内厔菔牵合扔缮贁祹讉€基因產物發(fā)揮作用，使部分信號通路活化，活化的信號通路又導致更多的基因轉錄，活化更多的信號通路；逐漸使不同的細胞出現基因表達差異，進而出現結構和功能的差異，最后細胞建立相對穩(wěn)定的、可傳遞的、與結構和功能相適應的基因表達模式。為了解腦發(fā)育和腦損失修復過程

2、中相關基因的表達變化，我室利用基因芯片技術對小鼠腦發(fā)育過程中基因進行篩選，獲得了1037條腦發(fā)育相關基因，Dbnl是在此研究中獲得的與軸突生長相關的7個基因之一。 Dbnl是新發(fā)現的小鼠drebrin基因成員，Shrao T研究證實Dbnl基因位于13<'＃>染色體中間位置，由660個氨基酸組成，翻譯后為120Kb大小蛋白，特異性表達在神經系統(tǒng)，初步研究表明其可能參與調節(jié)樹突棘的形成以及神經元的遷移。Drebrin是一種與腦發(fā)育

3、密切相關的蛋白，其特異性表達在神經系統(tǒng)，后來的研究顯示在非神經元內也存在有drebrin的亞類表達。目前在哺乳動物發(fā)現drebrin有四種亞類，他們都是單一基因通過不同的mRNA剪接方式形成。生物信息學分析表明，drebrin有且只有一個特異的區(qū)域與actin進行結合，這個區(qū)域位于drebrin的中心，去除這個結合位點，drebrin就不能與F-actin結合。drebrin通過與actin結合調節(jié)actin細胞骨架在細胞內的聚合和解聚

4、過程，進而引起細胞形態(tài)改變，對細胞分化遷移以及神經元突起的形成起重要的調節(jié)作用。 樹突形成被認為是成熟神經元突觸結構可塑性最顯著的特性，也是NSCs分化和遷移的重要特征和結構基礎。NSCs在分化和遷移過程中，一個最主要的形態(tài)學特征改變便是突起的形成和延長，分化成熟的神經細胞在到達遷移終點后，與其周邊的細胞通過樹突棘建立突觸(synapse)連接。樹突棘是神經元樹突的微小棘狀突起，在腦內也是多數突觸的突觸后成分，其最基本的細胞骨架

5、結構是F-actin。在樹突棘內，多種actin的連接蛋白和調節(jié)蛋白伴隨著軸突的生長和樹突的形成而呈現不同的表達模式，他們在調節(jié)軸突和樹突的形態(tài)學改變中發(fā)揮了重要的作用。因此，對細胞骨架蛋白以及相關調節(jié)蛋白的深入研究可能為解釋NSCs分化、遷移等機制問題提供新的理論思路。 基于Dbnl對神經元發(fā)育調節(jié)和突觸可塑性的調節(jié)作用，我們推測Dbnl影響NSCs分化和遷移，對NSCs分化后突觸連接的建立也具有促進作用，因此，本課題在了解D

6、bnl在小鼠腦發(fā)育和神經干細胞分化過程中表達模式和定位的基礎上，進一步探索Dbnl對小鼠NSC體外分化的可能影響，以及分化遷移后NSC在形成突觸連接過程中的作用和可能的機制。研究結果簡要如下： (1)以western blot和免疫組化等方法，了解Dbnl在小鼠腦發(fā)育過程中的表達模式和定位，結果顯示，在小鼠腦發(fā)育的不同階段，均有Dbnl蛋白的表達，其中在胚胎后期，Dbnl的表達達到高峰，隨后下降，出生以后表達再次上調，在出生7d

7、時最高，隨后又下降，成年以后Dbnl呈低水平表達表達；在腦內：Dbnl主要表達在海馬，室管膜，皮層等神經元和神經干細胞分布密集的區(qū)域；而Dbnl在細胞內的定位也有一定的時空模式，表現在胚胎時，Dbnl彌散分布在細胞的周邊，而出生以后Dbnl主要分布在細胞的突起。這些結果提示Dbnl不但在腦發(fā)育發(fā)育過程中調節(jié)神經元的發(fā)生以及突觸的形成，而且可能對神經干細胞的分化和遷移也具有一定影響。 (2)以western blot，real-t

8、ime PCR等方法，了解在NSCs分化過程中，Dbnl的表達變化模式，結果顯示，在NSCs分化過程中，Dbnl有不同程度的表達，其mRNA和蛋白表達的高峰在細胞分化的第3d時，在細胞內，Dbnl主要分布在細胞的突起；免疫熒光雙標顯示，Dbnl與細胞內的actin蛋白有明顯在共聚現象。這些結果提示：Dbnl可能調節(jié)NSCs的分化，對神經干細胞突起的形成具有一定的促進作用。 (3)從出生1d的小鼠腦內擴增出Dbnl的全長基因，進而

9、構建了EGFP-Dbnl真核表達載體，以電轉法將構建的載體成功導入體外培養(yǎng)的神經干細胞，在無其他因子作用下，過表達Dbnl的神經干細胞能正常分化，通過免疫熒光染色，了解過表達Dbnl后，神經細胞內actin、突觸后致密蛋白PSD-95和突觸蛋白Synapsinl的表達變化，結果發(fā)現，在轉染Dbnl以后，actin和synapsinl的表達無明顯影響，而PDS-95表達水平增加，但PSD-95與Dbnl表達并不完全的共聚。結果提示在NSC

10、s分化過程中，Dbnl與其結合的細胞骨架蛋白actin之間并無表達依賴關系，但能夠調節(jié)突觸相關蛋白在細胞內的表達水平，因此我們推測，Dbnl可能通過影響actin在細胞內的結構形式，進而影響突觸相關蛋白在樹突的表達水平。 (4)根據Dbnl的基因結構特點，我們設計和構建了Dbnl mRNA干擾載體，以病毒包裝的方式干擾體外培養(yǎng)的神經干細胞。觀察了在沉默細胞內源性Dbnl以后，細胞的分化狀態(tài)和相關蛋白的表達變化，結果發(fā)現，干擾Db