1、背景
　　膿毒癥(sepsis)是由感染所導致的全身炎癥反應綜合征,是機體對外源性致病微生物如細菌、真菌、病毒等進行免疫應答過程中所出現的失控的炎癥反應并最終可能導致多器官功能障礙。膿毒癥發(fā)病率高,大多病情危重,加之治療技術手段有限,因而成為現代危重病醫(yī)學所面臨的一個重大挑戰(zhàn)。病原體入侵機體后可被機體的抗原提呈分子識別,繼而與炎癥細胞結合,啟動炎癥反應,促進炎癥介質釋放。失衡的炎癥細胞活化及炎癥因子釋放,通過影響血流動力學、凝血及

2、細胞凋亡等機制進一步損害各臟器的功能。目前膿毒癥尚缺乏特效分子靶向治療,以使用抗生素、強化液體管理及實施支持治療為主導的治療策略并未能顯著降低膿毒癥患者的病死率,盡管2002年巴塞羅那宣言上提出通過集束化管理等措施在5年內減少25％膿毒癥患者病死率的遠景目標,但最終只減少了近6.2%的病死率。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內源性非編碼RNA,由21～25個核苷酸組成,通過形成miRNA核蛋白體復合物(miRNPs)與靶

3、標mRNA的堿基完全或部分配對,從而產生抑制或降解作用,調控目的基因的表達。研究表明,miRNA可在膿毒癥信號通路、炎癥介質產生、細胞凋亡及器官功能障礙等多個病理生理過程起調控作用,參與炎癥反應的細胞部分miRNA的表達變化明顯,可進入血液循環(huán),成為潛在的膿毒癥分子標志物。單核細胞系在膿毒癥早期炎癥反應過程中發(fā)揮主導性的作用,而脂多糖是革蘭陰性菌細胞壁的重要組分,也是目前研究最為透徹的病原相關分子模式,可通過刺激單核細胞誘發(fā)膿毒癥早期炎

4、癥反應。研究單核細胞在膿毒癥發(fā)生后miRNA表達譜的變化,有助于進一步明確膿毒癥的發(fā)病機制,阻斷膿毒癥的疾病進程。
　　目的：
　　1.研究THP-1細胞在LPS刺激下其miRNA表達譜的變化。
　　2.為進一步研究miRNA對炎癥反應的調控作用提供參考,并尋找可能的診斷性能優(yōu)越的膿毒癥分子標志物。
　　內容與方法
　　1.培養(yǎng)實驗用THP-1細胞并傳代,凍存及復蘇實驗用細胞。
　　2.分別以0ng/

5、ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/mlLPS刺激THP-1細胞,在刺激后6小時、12小時、24小時及48小時收集細胞上清液,應用ELISA法檢測不同LPS刺激濃度、不同刺激時長的細胞上清液內的IL-6水平,探索適宜的炎癥刺激條件。
　　3.實驗組以1000ng/mlLPS刺激THP-1細胞,對照組只添加RPMI-1640,每組各4個培養(yǎng)孔,48小時后分離培養(yǎng)液及細胞。ELISA法對培養(yǎng)液內的

6、IL-6水平進行測定,對細胞的炎癥反應進行驗證。
　　4.采用PBS洗液洗滌實驗組與對照組離心后分離得到的細胞,通過Trizo法提取總RNA并將其轉移入2mlEP管內,空白對照組4管標記1、2、3、4,實驗組4管標記5、6、7、8,進行妥善的封裝后放置于-80℃冰箱內。
　　5.委托博奧生物有限公司進行AgilentmiRNAmicroarray芯片檢測,采用AgilentFetureExtraction(v10.7)、Ag

7、ilentGeneSpring、GeneSpring等軟件進行數據處理及統計分析。
　　結果：
　　1.不同濃度LPS刺激THP1細胞在不同的時間段細胞所釋放的IL-6水平不同,刺激濃度越大,IL-6水平越高(P<0.05)。
　　2.從對數折線圖上可以看出,THP-1細胞IL-6分泌呈現出高度時間依賴性,刺激24小時以后IL-6水平顯著升高。
　　3.實驗組與對照組相比,部分miRNA出現顯著改變,實驗組hsa

8、-miR-21-5P、hsa-miR-146a-5P及hsa-miR-29b-3p等部分miRNA出現顯著上調,hsa-miR-16-5P、hsa-miR-92a-3P、hsa-let-7a-5P等部分miRNA表達出現顯著下調(所有P值均在10-4～10-7之間)。
　　結論：
　　1.內毒素脂多糖(LPS)能誘導THP-1細胞釋放IL-6;
　　2.LPS刺激濃度越大,THP-1細胞分泌的IL-6水平越高,IL-6