1、人類線粒體基因組DNA分子為一個16569bp的雙鏈環(huán)狀DNA分子，該基因組與核基因組相互獨立又互相依存，線粒體有13個編碼基因，22個tRNA和2個rRNA，許多疾病都與線粒體基因組相關(guān)。線粒體又有獨特的母系遺傳特性，是研究生物起源和進化的重要材料。K562細胞是人類慢性髓系白血病細胞，該細胞容易獲取，具有各種分化特性，是實驗室研究的重要材料。隨著人類基因組計劃的完成，各種測序手段相繼出現(xiàn)，人們在獲取遺傳序列信息方面更加方便，利用測序

2、手段研究線粒體基因組，對其進行正確的拼接和后續(xù)的功能注釋在診斷線粒體疾病，保護生物學(xué)和群體遺傳學(xué)，以及確定線粒體在進化上的地位都有重要作用意義。本論文以K562細胞線粒體基因組為研究對象，通過實驗的方法設(shè)計了一組對比實驗，分別用基于PCR的方法和基于多重置換擴增的全基因組等溫擴增來獲得線粒體基因組，然后利用一代Sanger測序方法和二代Illumina測序方法對我們獲取的線粒體基因組進行測序，最終獲得了K562細胞線粒體基因組序列信息。

3、
　　1、我們利用基于PCR的擴增方法，通過文獻綜述和預(yù)實驗最終確定了45對線粒體擴增引物，對線粒體環(huán)狀DNA分子的全長進行無縫擴增，每一個擴增片段長度不超過1000bp，每一個擴增片段的上下游都有一段的overlap。然后對這些擴增片段利用ABI的3730測序儀進行測序，獲取每一個擴增片段的序列信息。對于一代測序下機數(shù)據(jù)，我們使用NCBI數(shù)據(jù)庫的blast在線比對工具將我們的每一個擴增fragment與人類線粒體標(biāo)準(zhǔn)參考基因組(

4、NC—012920.1)進行比對，然后手動對這些比對后的片段進行手動拼接，最終獲得了K562細胞線粒體的完整基因組。
　　2、我們利用基于多重置換擴增的線粒體基因組等溫擴增方法對我們的K562細胞線粒體基因組進行擴增。我們使用QIAGEN公司的REPLI-g Mitochondrial DNA kit對我們的K562核酸樣本進行擴增，一般地線粒體DNA在提取過程中往往與核DNA很難分開，所以我們選擇對K562全基因組中線粒體DNA

5、進行特異性擴增。實驗過程中我們對樣本進行了不同程度的稀釋，發(fā)現(xiàn)將樣本稀釋到0.1個核DNA的單倍量級時（即3.3pg/uL），再進行線粒體基因組擴增后10組平行樣本中只有3個樣本擴增出。根據(jù)我們的全基因組稀釋樣本的測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在0.1個gDNA單倍量級時，線粒體DNA與gDNA的reads覆蓋度之比在4-16倍之間，這與我們的實驗結(jié)果比較類似，說明該線粒體基因組擴增試劑盒滿足我們實驗的要求。利用該試劑盒得到的線粒體基因組進行了二代Il

6、lumina測序。
　　3、一代測序數(shù)據(jù)在比對過程中，我們發(fā)現(xiàn)了39個單堿基突變位點和一個短片段缺失，這些突變位點分布在線粒體基因組的全長，包括rRNA、tRNA、D-Loop以及基因編碼區(qū)。我們將這些突變位點分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩部分，對于編碼區(qū)的突變位點分為錯義突變和無義突變分別討論相關(guān)的功能意義。我們利用的是NCBI基因數(shù)據(jù)庫、MITOMAP線粒體基因數(shù)據(jù)庫以及UniprotKB蛋白數(shù)據(jù)庫對我們的突變位點進行查找，我們發(fā)現(xiàn)大

7、多數(shù)突變位點都已經(jīng)存在于這些數(shù)據(jù)庫之中，我們根據(jù)查找到的信息對每個位點進行了功能注釋，分析總結(jié)了各位點的生物學(xué)意義。對于少量數(shù)據(jù)庫中查找不到的位點，我們利用Jpred蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測在線分析軟件分析了這些位點改變造成的氨基酸改變進而可能對整個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成的影響，并且分析了這種影響可能引起的功能變化。對于兩種不同方法獲得的線粒體基因組我們利用了二代Illumina測序方法進行了測序，并對兩種方法得到的測序結(jié)果進行了初步的比較，并且對一代測