1、局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)是常見的腎小球疾病，占我國成人原發(fā)性腎小球腎炎的7.0％，臨床上表現(xiàn)為大量蛋白尿，早期研究表明足細胞損傷與大量蛋白尿的產生密切相關，足細胞受損、脫落構成腎小球硬化發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)。細胞免疫功能異常在FSGS發(fā)病機制中起著重要作用，F(xiàn)SGS患者T細胞釋放的細胞因子可導致足細胞損傷，其中Th2細胞因子，如IL-13和IL-4被認為可能是主

2、要致病因子，在腎病綜合征復發(fā)患者，CD4+和CD8+T細胞的IL-13和IL-4 mRNA表達升高，同時胞漿IL-13和IL-4蛋白水平表達也升高。原位雜交技術檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SGS患者腎組織中IL-13和IL-4 mRNA表達增加，且腎小管間質區(qū)IL-13和IL-4 mRNA表達量與腎功能變化及24h尿蛋白排泄呈正相關。有研究表明，足細胞上表達IL-13受體和IL-4受體，IL-13和IL-4與相應受體結合，可直接損傷足細胞骨架結構，破壞

3、細胞間連接蛋白，造成濾過膜通透性的破壞。 FSGS患者足細胞損傷的同時，常伴隨腎小管上皮細胞損傷，這點在組織形態(tài)和功能上都有明確的體現(xiàn)，并成為FSGS診斷和鑒別診斷的一個重要特點。既往的觀點認為大量蛋白尿致腎小管上皮細胞損傷、腎小球節(jié)段硬化致出球小動脈狹窄和相應腎單位缺血性損傷、腎小球毛細血管襻和包曼囊壁粘連使尿液反滲入腎間質觸發(fā)間質炎癥反應是FSGS腎小管間質損傷的原因，但這些機制可能造成的組織損傷及其轉歸不足以完全解釋臨床

4、上觀察到的現(xiàn)象。部分表現(xiàn)為超大量蛋白尿(＞10g/24h)的FSGS患者，尿蛋白譜分析往往是大分子和小分子蛋白混合存在，這種情況只有在近曲腎小管吸收功能嚴重受損時才會發(fā)生；一些對治療敏感的患者，在大量蛋白尿緩解的同時，反映腎小管損傷的指標也迅速地得到改善，這類患者腎活檢病理常常伴有近端腎小管的急性損傷，于是我們推測，是否可能有一些導致足細胞病變的因素同時直接攻擊了腎小管上皮細胞，使其功能和結構發(fā)生改變，進而觸發(fā)后續(xù)的間質病變以及間質纖維

5、化。既然乙證實IL-13和IL-4可通過足細胞上IL-13受體和IL-4受體導致足細胞損傷，那么，我們推測，在FSGS患者腎小管上皮細胞損傷中可能也存在同樣的分子發(fā)病機制。為探討IL-13和IL-4對近端腎小管上皮細胞的損傷作用，本研究借助人近端腎小管上皮細胞系(HK2)，研究人近端腎小管上皮細胞IL-13受體和IL-4受體的表達及IL-13和IL-4對腎小管上皮細胞的影響，并探討其作用機制。 本研究由兩部分組成： 第一

6、部分：腎小管上皮細胞IL-13受體和IL-4受體的檢測 目的： 檢測人近端腎小管上皮細胞IL-13受體和IL-4受體的表達。 方法： 1．細胞人近端腎小管上皮細胞系(HK2)購自ATCC(CRL-2910TM)。 2．用RT-PCR和免疫熒光方法分別從mRNA水平和蛋白質水平檢測HK2細胞上IL-13受體和IL-4受體的表達。 結果： 1．RT-PCR結果顯示正常培養(yǎng)的HK2細胞有

7、IL-13Ⅰ型受體和IL-4Ⅱ型受體的組成亞鏈-IL-13Rα1和IL-4Rα的mRNA表達。 2．免疫熒光結果顯示正常培養(yǎng)的HK2細胞有IL-13Ⅰ型受體和IL-4Ⅱ型受體的組成亞鏈-IL-13Rα1和IL-4Rα蛋白質表達，呈顆粒狀均勻分布在HK2胞漿中。 結論： 人近端腎小管上皮細胞表達IL-13Ⅰ型受體和IL-4Ⅱ型受體。 第二部分：IL-13受體和IL-4受體在腎小管損傷中的作用 目的：

8、 通過觀察IL-13和IL-4對近端腎小管上皮細胞的損傷標志物RANTES以及信號傳導通路JAK-STAT6的影響情況，分析IL-13和IL-4對腎小管上皮細胞的損傷作用，并探討其機制。 方法： 1．IL-13和IL-4對HK2細胞的影響作用 用免疫熒光的方法觀察分別用不同濃度(10ng/ml、50ng/ml和100ng/ml)的IL-13和IL-4干預HK2細胞12-48小時后HK2損傷標志物RANTE

9、S的變化情況。 2．IL-13和IL-4對HK2細胞的損傷機制 1)Western blot方法檢測不同時間-濃度的IL-13和IL-4分別干預HK2細胞后，JAK-STAT6信號通路的活化情況。 2) Western blot方法檢測JAK-STAT6信號通路特異性抑制劑--來氟米特對IL-13和IL-4作用HK2細胞的JAK-STAT6信號通路激活的影響。 3)用免疫熒光的方法觀察來氟米特對IL-13

10、和IL-4作用HK2細胞后RANTES變化的影響。 結果： 1．IL-13和IL-4呈時間-劑量依賴性影響近端腎小管上皮細胞RANTES的表達。50ng/ml IL-13、100ng/ml IL-4作用HK2細胞48h后的損傷作用最為明顯。正常培養(yǎng)的HK2細胞RANTES呈陰性，50ng/ml IL-13和100ng/ml IL-4干預48小時后，陽性細胞顯著增多。 2．IL-13處理組的JAK-STAT6磷酸化

11、水平在50ng/ml作用10min時開始升高(磷酸化水平為對照組的222.4％±81.9％)，在50ng/ml20min時達高峰，(磷酸化水平為對照組的307.8％±40.7％)；IL-4處理組的JAK-STAT6磷酸化水平亦在50ng/ml作用10min時開始升高(磷酸化水平為對照組的294.0％±59.7％)，并于100ng/ml20min時達高峰，(磷酸化水平為對照組的1618.0％±229.9％)。 3．來氟米特干預＋I

12、L-13處理組和來氟米特預干預+IL-4處理組與陰性對照相比，JAK-STAT6磷酸化水平均無明顯變化，磷酸化水平與陰性對照組相比分別為：43.6％±0.4％vs41.2％±2.4％，P＞0.05，20.6％±0.8％vs14.9％±6.7％，P＞0.05，無統(tǒng)計學差異；而較陽性對照STAT6磷酸化水平明顯降低，相比分別為：43.6％±0.4％vs89.3％±8.3％，P＜0.01，20.6％±1.4％vs44.8％±7.5％，P＜0.