1、我國梨產(chǎn)區(qū)種植的梨樹普遍感染蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)，對樹勢、產(chǎn)量和品質(zhì)都有嚴重影響。目前，預防果樹病毒的有效措施是獲得無病毒苗木，而熱處理結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)是獲取無病毒苗的有效方法，但熱處理脫除病毒的分子機理尚不清楚。本研究對37℃ld、5d莖尖組織混合樣品，24℃1d、5d莖尖組織混合樣品分別進行small RNA高通量測序和qRT-PCR分析驗證，一方面探索熱處理對梨miRNA以及

2、miRNA調(diào)控的靶標基因的影響，另一方面探索熱處理對沙梨中ASGV基因沉默發(fā)生的影響，旨在明確熱處理脫除梨莖尖病毒分子機理。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、臕SGV-J2全長序列擴增及分析:ASGV-J2基因組全長為6497nt（不含PloyA尾），與國內(nèi)外報道的17個ASGV分離物的基因組核苷酸相似性為79.6-82.6％，其中與來源于日本的蘋果分離物P-209和中國蘋果分離物T-47相似性最高，均為82.6％。ASGV-J2基因組

3、結(jié)構(gòu)同其它ASGV分離物相同，包括兩個開放閱讀框（ORF1和ORF2）。ORF1編碼的外殼蛋白cp基因與報道的中國分離物氨基酸相似性為94.1-98.7％，與來源中國的蘋果分離物YTG相似性最高。ASGV-J2基因組核苷酸序列和cp氨基酸序列進化樹分析表明，不同ASGV分離物具有明顯的寄主選擇性。本研究明確了侵染“金水二號”ASGV-J2分離物分子特性，進一步為熱處理對“金水二號”寄主體內(nèi)來源于ASGV的vsiRNAs的研究提供材料。<

4、br>　?、菩NA高通量測序發(fā)掘不同溫度處理條件下被ASGV感染的沙梨“金水二號”莖尖組織部位microRNAs的分析:24℃和37℃條件下共鑒定了149個已知miRNA，在梨寄主中表達量相對較高;熱處理條件下7個miRNA顯著差異表達，其中4個差異表達miRNA共預測到51個靶標基因;保守家族miRNA156和miRNA159分別有4個成員，其余多為2個成員。另外，共鑒定了144個新的miRNA，在梨莖尖文庫中表達量均較低;其中77

5、個miRNA為熱處理條件下顯著差異表達，其中64個差異表達miRNA預測到693個靶標基因。新的miRNA成熟序列5'端第一個堿基為U，表明miRNA行使功能時對AGO1蛋白有偏好性;熱處理條件下梨差異表達miRNA調(diào)控的靶標基因GO功能分析表明，靶基因涉及代謝，刺激反應(yīng)等生物過程，參與抗病防衛(wèi)反應(yīng)，激素信號轉(zhuǎn)導途徑等;表明熱處理誘導下miRNA在梨寄主基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面有重要作用，在寄主與病原互作中起重要調(diào)控作用。
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6、件miRNA及靶基因表達模式與病毒累積量的對應(yīng)分析:采用qRT-PCR法對37℃熱處理條件下差異表達顯著的miRNA(選取4個已知miRNA，8個新的miRNA)在梨莖尖和基部組織部位表達模式進行分析，驗證結(jié)果表明9個miRNA在梨莖尖組織表達量與小RNA高通量測序分析結(jié)果一致;結(jié)合miRNA在梨基部與莖尖部位不同表達模式，從而表明熱處理條件下梨寄主miRNA表達模式具有組織特異性。另外，關(guān)聯(lián)分析了miRNA靶標基因在梨莖尖和基部的表達

7、模式，結(jié)果表明莖部組織miRNA大多負調(diào)控相應(yīng)靶標基因。ASGV外殼蛋白cp基因在熱處理條件下梨莖尖和基部表達量均降低，表明熱處理抑制了病毒在寄主體內(nèi)的復制。因此，熱處理條件下miRNA及調(diào)控靶標基因在梨莖尖和基部表達模式與病毒積累量的對應(yīng)分析結(jié)果揭示了miRNA調(diào)控靶標基因在降低梨病毒濃度過程中具有重要的調(diào)控作用。
　?、葻崽幚韺碓从贏SGV的vsiRNAs的影響:24℃和37℃條件下，來源于ASGV的vsiRNA數(shù)量分別為7

8、495 reads和7949 reads，長度大小均以21nt和22nt為主;vsiRNAs對正鏈具有一定偏向性。vsiRNAs在ASGV基因組上分布無明顯差異，表明高溫并沒有觸發(fā)vsiRNAs表達量增多。采用qRT-PCR分析37℃與24℃處理條件下，來源于ASGV正義鏈ORF1、RdRp、Helicase區(qū)域及負義鏈ORF1、CP區(qū)域的vsiRNA的表達模式，結(jié)果表明熱處理對其表達量無明顯影響，與數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致;僅來源于ASGV負