1、目的：
　　急性髓細(xì)胞白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是一組高度異質(zhì)的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。細(xì)胞遺傳學(xué)異常是AML疾病診斷、評(píng)價(jià)預(yù)后和治療方案的選擇中最重要的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)之一。
　　Thermo Life公司基于其多年做PCR的經(jīng)驗(yàn)，推出了AmpliSeq建庫方案，該專利技術(shù)以多重PCR為反應(yīng)基礎(chǔ)，同時(shí)又突破了以往多重PCR的已知障礙，僅利用少量的起始DNA，就可以實(shí)現(xiàn)成千上萬個(gè)目標(biāo)基因的擴(kuò)增能夠在

2、單管多重PCR反應(yīng)內(nèi)完成。新設(shè)計(jì)的試劑盒一方面盡可能的囊括目前有臨床指導(dǎo)意義的基因，另一方面，也希望能發(fā)現(xiàn)一些新的位點(diǎn)異常。本課題第一部分的目的在于研究Ion Torrent PGMTM測(cè)序平臺(tái)及自制的AML CancerPanel在AML臨床診斷中的方法學(xué)建立。
　　伴有t(8;21)(q22;q22)遺傳學(xué)異常的AML是較常見的一類AML，約占成人AML的10％-15％，90％的t(8;21)易位發(fā)生在FAB分型AML-M2中

3、，其余見于M0、M1、M4及骨髓增生異常綜合征(MDS)和治療相關(guān)性AML中，伴有這類染色體易位的AML通常被認(rèn)為預(yù)后較好，特別是高劑量阿糖胞苷作為強(qiáng)化鞏固治療手段后，但此類AML異質(zhì)性較大，仍然有30-50％的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)并對(duì)化療藥物耐藥。提示了一些患者可能伴有不良的分子事件，并暗示我們需要尋找新的提示預(yù)后的標(biāo)記并據(jù)此來調(diào)整治療方案。以往研究基因突變的傳統(tǒng)方法Sanger測(cè)序因技術(shù)本身的局限性，使其在研究基因突變譜時(shí)受到了很大的限制，

4、因此對(duì)t(8;21)AML細(xì)胞基因突變研究往往集中在有限的目標(biāo)基因中。更鮮有報(bào)道從大范圍目標(biāo)基因水平上來比較t(8;21) AML初發(fā)和復(fù)發(fā)時(shí)的基因突變譜變化。本課題第二部分利用新建立的Ion TorrentPGMTM測(cè)序平臺(tái)，對(duì)t(8;21) AML患者初發(fā)和復(fù)發(fā)時(shí)自身配對(duì)骨髓標(biāo)本的基因突變情況進(jìn)行檢測(cè)，以期從分子生物學(xué)角度分析t(8;21)AML患者初發(fā)和復(fù)發(fā)時(shí)的克隆演化情況，為該類患者選擇合適的再治療措施提供依據(jù)。
　　方法

5、：
　　第一部分
　　1、目標(biāo)基因篩選和多重PCR引物設(shè)計(jì)
　　2、樣本準(zhǔn)備
　　按照DNA提取試劑盒說明書操作，分別從骨髓細(xì)胞涂片和新鮮骨髓標(biāo)本中提取核酸。
　　3、NGS測(cè)序。
　　4、Sanger測(cè)序。
　　第二部分
　　1、NGS測(cè)序方法與第一部分相同。
　　2、Sanger測(cè)序。
　　3、突變位點(diǎn)致病性預(yù)測(cè)。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1、Ion

6、 AmpliseqTM Desinger多重PCR引物設(shè)計(jì)方案
　　用Ion AmpliseqTM Desinger對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)多重PCR引物，設(shè)計(jì)方案結(jié)果:共652個(gè)擴(kuò)增子，可以覆蓋98.03％的目標(biāo)區(qū)域，PCR擴(kuò)增在兩管內(nèi)完成，分別有332和320個(gè)擴(kuò)增子，擴(kuò)增子的長度在125bp和275之間。
　　2、NGS質(zhì)控
　　以一張芯片結(jié)果為例，測(cè)序結(jié)果顯示:芯片中磁珠覆蓋面積為80％，其中連接有文庫的為100％，除去

7、34％的多克隆，12％的低質(zhì)量文庫和1％測(cè)試片段，最終有效的文庫為57％，共2，884，511個(gè)讀取片段;產(chǎn)生的原始測(cè)序數(shù)據(jù)總量為409Mb;平均擴(kuò)增子長度為139bp;測(cè)序每次添加核苷酸時(shí)，釋放的H+強(qiáng)度較一致;不同位置堿基的準(zhǔn)確度都在98％以上;其中達(dá)到Q20(與參考序列99％匹配)的為352 Mb。單個(gè)樣品測(cè)序質(zhì)控顯示:測(cè)序覆蓋度較均一，可以與靶標(biāo)區(qū)比對(duì)上的reads總數(shù)為493，804，占總靶標(biāo)區(qū)的96.15％，每個(gè)堿基的平均覆

8、蓋度為517，堿基覆蓋的均一度為85.15％，可以被reads覆蓋的靶標(biāo)區(qū)的堿基比例為94.51％，靶標(biāo)區(qū)內(nèi)至少有20條reads比對(duì)上的堿基的比例為97.47％，沒有正/反鏈偏好性的堿基的比例為81.92％，大部分?jǐn)U增子的GC含量都在50％附近，每個(gè)擴(kuò)增子的覆蓋度比較均一，大部分分布在100-1000x之間，能從頭到尾測(cè)通的reads大部分超過了50％。說明NGS質(zhì)控合格。
　　3、樣本突變整體分布
　　經(jīng)過查詢dbSNP

9、、COSMIC等數(shù)據(jù)庫以及參照文獻(xiàn)報(bào)道，去除常見SNP位點(diǎn)后，67個(gè)目標(biāo)基因中，有兩例以上出現(xiàn)重現(xiàn)性突變的基因共有18個(gè)，突變類型包括單堿基替換、插入和缺失。突變發(fā)生頻率最高的是NPM1、DNMT3A、FLT3和TET2（突變頻率分別為22.2％，22.2％，18.5％和18.5％）。如:NPM1的插入突變集中在12號(hào)外顯子上4個(gè)堿基的插入(c.859_860insTCTG，c.861_862insTGCA)，其中5例患者為A型突變，均

10、插入TCTG四個(gè)堿基，引起NPM1蛋白C端的框移突變;FLT3突變有兩種模式，插入突變和點(diǎn)突變，3例為發(fā)生在近膜結(jié)構(gòu)域14、15外顯子的內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(ITD)插入，2例為激酶結(jié)構(gòu)域20外顯子的第835個(gè)天門冬氨酸的點(diǎn)突變(TKD)，其中1例患者同時(shí)有ITD和TKD兩種突變。DNMT3A和TET2屬于表觀遺傳調(diào)節(jié)基因子，以點(diǎn)突變?yōu)橹鳎珼NMT3A檢出的6例突變中，5例為發(fā)生在23號(hào)外顯子上第882位點(diǎn)精氨酸的點(diǎn)突變，其中4例為R882H，

11、1例為R882C。測(cè)序結(jié)果不但可以顯示基因突變的類型，在染色體上的位置，還可以顯示突變堿基所占的比例，進(jìn)而可以用于疾病進(jìn)展過程中微小殘留的監(jiān)測(cè)。
　　4、Sanger測(cè)序結(jié)果
　　對(duì)所有標(biāo)本的FLT3-ITD(exon14、15)、NPM1(exon12)和DNMT3A(R882位點(diǎn)附近)進(jìn)行經(jīng)典的Sanger測(cè)序，共檢測(cè)到:FLT3-ITD陽性4例，NPM1陽性6例，DNMT3A陽性5例。與NGS結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，在擴(kuò)增目的片

12、段一致的前提下，NPM1和DNMT3A的檢測(cè)兩種方法有很好的一致性，Sanger測(cè)序檢測(cè)到FLT3-ITD突變4例陽性樣品中，僅有1例用NGS未測(cè)出。
　　第二部分
　　1、NGS質(zhì)控
　　本部分研究檢測(cè)的芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控均合格，所有測(cè)序樣本的測(cè)序深度均在100-399X之間，90％以上的序列可以與靶標(biāo)區(qū)目的序列比對(duì)上，靶標(biāo)區(qū)堿基覆蓋度較均一。
　　2、NGS測(cè)序結(jié)果
　　對(duì)11例t(8;21) AML患者初診

13、和復(fù)發(fā)時(shí)的自身配對(duì)骨髓標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行了NGS測(cè)序，結(jié)果顯示:所有檢出的突變以雜合型突變?yōu)橹鳎以诔醢l(fā)和復(fù)發(fā)時(shí)的突變細(xì)胞比例基本一致?；蛲蛔冾愋鸵詥螇A基替換為主。這些復(fù)發(fā)的患者在初診時(shí)每例檢測(cè)到1-4個(gè)基因突變，發(fā)生頻率最高的是C-KIT(6/11)，包括D816(exon17)突變3例（其中，D816Y、D816H、D816V各1例），N822(exon17)突變1例，M541(exon10)1例，R815_D816ins(exon1

14、7)1例;ASXL1、MLH1和TET2突變各2例;FBXW7、DNMT3A、NRAS和DNMT3B突變各1例。復(fù)發(fā)時(shí)，原有的6例C-KIT突變僅有4例仍然存在，2例丟失;新獲得了KIT P665突變1例，KIT P665、KIT N822突變1例。與初次診斷時(shí)相比，復(fù)發(fā)時(shí)有5例患者的基因突變模式未發(fā)生變化，6例發(fā)生了變化，其中新獲得的基因包括KMT2A、C-KIT、TET2和SH2B3，丟失的原有基因包括C-KIT和NRAS。分別有2

15、例患者在復(fù)發(fā)時(shí)獲得了KMT2A、C-KIT、TET2突變，1例獲得了SH2B3突變;2例患者復(fù)發(fā)時(shí)丟失了C-KIT，1例丟失了NRAS。
　　3、Sanger測(cè)序結(jié)果及其驗(yàn)證
　　為了驗(yàn)證NGS測(cè)序結(jié)果的可靠性，用Sanger方法測(cè)序檢測(cè)了所有標(biāo)本的C-KIT外顯子8、17的突變情況。在初次診斷標(biāo)本中檢測(cè)出17外顯子突變5例（D8163例，N8221例，R815_D816ins1例），復(fù)發(fā)標(biāo)本檢測(cè)出17外顯子突變3例（D81

16、6、N822和R815_D816ins各1例），未檢測(cè)出8號(hào)外顯子突變，結(jié)果顯示兩種方法的一致性為100％。
　　4、重現(xiàn)性突變的MLH1致病性測(cè)序結(jié)果
　　測(cè)序結(jié)果顯示，有2例患者在初次診斷和復(fù)發(fā)時(shí)均出現(xiàn)MLH1c.1151T＞A突變，在本研究第一部分正常核型AML患者的基因突變譜中，也檢測(cè)出3例患者攜帶該突變，因此對(duì)該突變的原始結(jié)果進(jìn)行了仔細(xì)分析，該位點(diǎn)的測(cè)序深度均在100X以上，均為雜合突變，位于其擴(kuò)增子的中間部位。三

17、款軟件來預(yù)測(cè)該突變位點(diǎn)的致病性，polyphen-2預(yù)測(cè)的得分為0.998，為probably damaging;mutationtaster預(yù)測(cè)的結(jié)果為disease causing;MAPP-MMR預(yù)測(cè)的得分為5.120（得分大于4.55為具有致病性）。
　　結(jié)論：
　　1、本研究采用Ion Torrent PGMTM測(cè)序平臺(tái)，在原有商業(yè)化實(shí)體腫瘤基因突變?cè)噭┖械幕A(chǔ)上成功加載了對(duì)AML預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值的17個(gè)基因，經(jīng)過

18、27例染色體核型正常的AML患者樣本的檢測(cè)以及與經(jīng)典的測(cè)序方法比較，結(jié)果證明成功的建立了一套靈敏特異、可靠、高通量的AML突變檢測(cè)方法。
　　2、Ion Torrent PGMTM在長片段插入或缺失和單個(gè)堿基出現(xiàn)多次重復(fù)(即Homopolymer)區(qū)段的檢測(cè)中還有一定的缺陷。
　　3、在動(dòng)態(tài)研究初次診斷和緩解后復(fù)發(fā)的伴有t(8;21)染色體核型異常的AML患者中，發(fā)現(xiàn)大部分患者出現(xiàn)了與初次診斷時(shí)不同的基因突變模式，其中C-K