1、第一部分人外周血CD34+細胞的體外原代培養(yǎng)鑒定及生物學特性
　　目的:通過梯度密度離心法和免疫磁珠分離法從人體外周血中獲取CD34+細胞，在體外原代培養(yǎng)、擴增、鑒定、凍存與復蘇，探討其生物學特性，為患者再次干細胞移植提供可能的干細胞來源。
　　方法:使用梯度密度離心法采集人外周血中單個核細胞，應用免疫磁珠吸附法獲取CD34+細胞，在含有生長因子的X-VIVO培養(yǎng)液和高糖DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)擴增。光鏡觀察細胞形態(tài)、生長特

2、性;全自動活細胞觀測分析系統(tǒng)(Cell-IQ)動態(tài)觀察細胞分裂及遷移;免疫熒光技術對其表面標志物CD34及CD133進行鑒定;凍存CD34+細胞1年后復蘇觀察細胞活性。
　　結果:原代培養(yǎng)的CD34+細胞在X-VIVO培養(yǎng)液中呈懸浮生長，3d細胞集落形成，5d有少量細胞開始貼壁生長，7d紡錘形的細胞數(shù)量增多，9d開始出現(xiàn)細胞碎片，此時懸浮細胞與貼壁細胞分開培養(yǎng)，貼壁細胞用高糖DMEM培養(yǎng)，懸浮細胞繼續(xù)用X-VIVO培養(yǎng)，14d懸浮

3、細胞大部分死亡，貼壁細胞集落形成。Cell-IQ動態(tài)觀察細胞平均的分裂時間為90分鐘，幾乎所有的懸浮細胞均向中央移動。免疫熒光鑒定細胞表面標志物CD34(+)和CD133(+)。-80℃冰箱直接凍存，1年后復蘇，應用Cryostor凍存液，細胞活力為(89.0±2.58)％，應用DMSO凍存液細胞活力為（84.9±3.28）％，兩者有統(tǒng)計學意義。
　　結論:純化的CD34+細胞在體外培養(yǎng)擴增是可行的，凍存復蘇后對細胞的活力影響較小

4、，為患者再次移植提供足夠的干細胞來源成為可能。
　　第二部分CD34+細胞移植治療裸鼠后肢缺血的實驗研究
　　目的:觀察人外周血CD34+細胞移植治療裸鼠后肢動脈缺血的效果，并且探討其可能的機制。
　　方法:裸鼠36只，隨機分為CD34組、X-VIVO組和假手術組，每組12只，CD34組、X-VIVO組剝離左側股動脈至胭動脈水平，制備成裸鼠后肢動脈缺血模型，觀察其后肢缺血情況，假手術組不剝離血管，其余同前兩組。飼養(yǎng)1周

5、后CD34組裸鼠給予含有CD34+細胞(1×105cells)的X-VIVO培養(yǎng)液0.1ml注射于患肢缺血肌肉組織中，X-VIVO組裸鼠注射不含CD34+細胞的X-VIVO培養(yǎng)液0.1ml，假手術組僅注射生理鹽水0.1ml，飼養(yǎng)2周后取裸鼠內收肌和半膜肌標本，抗CD31和抗CD34免疫組織化學染色，顯示血管內皮細胞、血管密度;RealTime-PCR檢測組織中VEGF和bFGF mRNA的表達情況;
　　結果:免疫組化染色顯示CD

6、34組微血管密度較X-VIVO組和假手術組明顯增加。RT-PCR檢查顯示CD34組VEGF和bFGF mRNA表達最強，其次是X-VIVO組(P＜0.05)，假手術組則最低(P＜0.05)。
　　結論:應用CD34+細胞移植可以明顯促進血管新生、側枝血管形成進而增加下肢缺血組織的血流灌注。
　　第三部分純化自體外周血CD34+細胞移植治療肢體重度缺血的臨床研究
　　目的:研究臨床應用粒細胞集落刺激因子(G-CSF)動員

7、后經(jīng)外周血采集單個核細胞(PB-MNC)，免疫磁珠分選儀提取純化CD34+細胞移植治療肢體重度缺血的安全性，可行性和有效性。
　　方法:自2009年5月至2011年7月，入組患者共25例，其中治療下肢25條和上肢3條，平均年齡44±12歲，均不具備外科血管重建條件。G-CSF(5-10μg/kg)動員第5天采集外周血單個核細胞，分選獲得純化CD34+細胞，肢體肌肉局部注射，所有病例分為3組:低劑量組(105/kg)、中劑量組(5×

8、105/kg)和高劑量組(106/kg)。觀察不良反應和缺血緩解情況。
　　結果:隨訪6-33個月，1個月和2個月時Wong-Baker FACES疼痛評分由術前7±2分別下降到3±3(P=0.0000)和1±2(P=0.0000);3個月和6個月時，平板試驗無疼痛步行時間從術前4±3min上升到13±7min(P=0.0005)和18±6min(P=0.0000);踝肱指數(shù)從術前0.46±0.21上升到0.60±0.17(P=0

9、.003)和0.67±0.15(P=0.001);經(jīng)皮氧分壓由27±10mmHg升至41±11mmHg(P=0.0001)和55±12mmHg(P=0.0000);14例潰瘍患者愈合10例，4例在3個月內行截肢術;Kaplan Meier生存分析法計算6個月保肢率為84％(95％可信區(qū)間為0.63～0.94)。比較3組（低劑量組5例;中劑量組11例;高劑量組9例），1個月時Wong-Baker FACES疼痛評分高劑量組(6.3±1.7