1、目的：胰腺癌是一種高度惡性的消化道腫瘤,近年來其發(fā)病率國內(nèi)外均有明顯升高的趨勢。在歐美胰腺癌死亡率在所有的惡性腫瘤中居第五位,在消化道癌中胰腺癌的發(fā)病率和死亡率僅次于結(jié)直腸癌,居第二位。在我國胰腺癌是死亡率第6位的常見惡性腫瘤。胰腺癌惡性程度高,起病隱匿,不易早期發(fā)現(xiàn),臨床診斷病例時多為中晚期,患者預后差,術后5年生存率低,迄今無論是早期診斷還是治療均是最困難的惡性腫瘤之一。目前研究認為,胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個多基因參與、多階段發(fā)展的

2、過程,它與眾多基因的表達及相互作用有關,而這些基因的表達是決定胰腺癌表型多樣性的分子基礎。因此從基因水平研究胰腺癌的發(fā)生發(fā)展機理,并選擇胰腺癌特異性基因進行早期診斷和基因治療已成為這一領域的研究熱點?；蛐酒夹g是近年來新興的一項生物技術,它是利用芯片技術中信息集成化和平行處理化原理,收集成千上萬個特定的寡核苷酸或DNA片段有序地高密度地排列在特定載體上,通過堿基互補配對原理進行雜交。利用基因芯片可以進行高通量的生物信息處理,確定腫瘤細

3、胞的基因表達譜,尋找新的腫瘤相關基因及關鍵性調(diào)控基因,以及應用于腫瘤的基因診斷。本研究就是通過基因芯片技術篩選出胰腺癌表達差異的基因:對表達顯著差異的‘TBX2進行基因和蛋白水平的檢測;分析TBX2表達情況與胰腺癌臨床病理特征的關系;探討TBX2基因在胰腺癌中所參與的信號通路。
　　 材料和方法：
　　 1、應用基因芯片技術檢測胰腺癌及癌旁正常組織中基因變化情況。
　　 方法:取組織標本,提取總RNA,cDNA合

4、成,標記及純化,芯片雜交及洗脫,芯片檢測。
　　 2、對表達顯著差異的候選基因,通過生物信息學查閱各基因的研究現(xiàn)狀,進一步挖掘潛在的生物信息,篩選出胰腺癌下一步研究的目的基因。rBX2。
　　 3、采用RT-PCR方法,檢測胰腺癌和癌旁正常組織中表達顯著差異的目的基因TBX2的mRNA變化情況。方法:取組織標本,提取總RNA,擴增目的基因,觀察TBX2在mRNA水平的變化情況。
　　 4、采用Western bl

5、ot方法,檢測胰腺癌和癌旁正常組織中表達顯著差異的目的基因TBX2的蛋白表達情況。方法:提取蛋白,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,免疫反應,觀察TBX2在蛋白水平的表達變化。
　　 5、采用免疫組織化學ABC法檢測胰腺癌和癌旁正常組織中TBX2的表達程度,分析其與胰腺癌發(fā)生部位、腫瘤大小、病理分化、腫瘤轉(zhuǎn)移、臨床分期、患者年齡及性別等臨床病理特征之間的關系。
　　 6、用Janus激酶抑制劑AG490阻斷胰腺癌細胞株AsPC

6、-1的STAT3信號通路,應用實時定量PCR方法檢測TBX2基因與STAT3通路之間的關系。
　　 方法:細胞培養(yǎng),提取RNA,cDNA的合成,熒光實時定量PCR來觀察TBX2基因與STAT3基因的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、胰腺癌基因表達譜芯片顯示各克隆點點樣均勻,雜交信號穩(wěn)定,按基因芯片差異顯著陽性標準,篩選出胰腺癌組織中差異表達(Ratio值＞2或＜0.5)基因155種,其中表達上調(diào)的92種,表達下

7、調(diào)63種,涉及到細胞周期調(diào)控基因、癌基因與抑癌基因、腫瘤細胞凋亡基因、轉(zhuǎn)錄因子及調(diào)控基因、細胞生長和分化基因、信號轉(zhuǎn)導基因、細胞骨架和細胞粘附基因等多種基因類型的改變。其中Ratio值＞3和＜0.333倍差異表達的基因12種,結(jié)合生物信息學檢索,對顯著差異表達基因的研究現(xiàn)狀進行逐一分析,篩選出胰腺癌進一步研究的目的基因TBX2。
　　 2、采用RT-PCR方法檢測胰腺癌與癌旁正常組織中TBX2基因mRNA的水平,采用Wester

8、n blot方法檢測胰腺癌與癌旁正常組織中TBX2基因蛋白的表達情況。研究結(jié)果表明,在胰腺癌組織中TBX2的mRNA和蛋白表達均較癌旁正常組織有明顯增加(P＜0.05)。一方面驗證了前面基因芯片篩選結(jié)果的可靠性,另一方面為下面胰腺癌臨床病理關系的研究提供實驗基礎。
　　 3、通過免疫組織化學染色ABC法,有29例(60.4％)胰腺癌標本可見免疫組化染色呈強表達,而在正常胰腺標本中沒有發(fā)現(xiàn)強表達的免疫組化染色。TBX2在胰腺癌組織

9、中強表達例數(shù)明顯高于正常胰腺標本。通過。TBX2與胰腺癌臨床病理特征關系的觀察發(fā)現(xiàn),已發(fā)生轉(zhuǎn)移的胰腺癌病例TBX2表達高于沒有轉(zhuǎn)移的病例,提示TBX2的表達與胰腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關。存低分化腫瘤中TBX2表達明顯高于中高分化腫瘤,提示TBX2表達與腫瘤分化程度相關。在TNM分期中胰腺癌晚期病例TBX2的表達較中早期病例更為顯著。而TBX2表達變化在患者年齡、性別、腫瘤直徑和發(fā)生位置等方面無統(tǒng)計學差異。
　　 4、實時定量PCR實驗

10、表明AG490可以明顯抑制胰腺癌細胞株.AsPC-1中STAT3和TBX2 mRNA的水平。AG490作用于AsPC-1細胞48小時后,抑制劑濃度為5μmol/L組的STAT3和TBX2的mRNA相對變化略低于對照組;抑制劑濃度為10μmol/L組的STAT3和TBX2的mRNA相對變化明顯低于對照組(P＜0.05);抑制劑濃度為20μmol/L組的STAT3和TBX2的mRNA相對變化更低于對照組(P＜0.01),經(jīng)過雙變量相關分析證

11、實STAT3與TBX2兩者呈正相關。
　　 結(jié)論：
　　 1、通過基因芯片技術檢測發(fā)現(xiàn),并應用RT-PCR、Western blot方法驗證TBX2在胰腺癌組織中存在高表達,TBX2在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中很可能具有重要作用。
　　 2、TBX2表達變化與胰腺癌病理分化、腫瘤轉(zhuǎn)移、臨床分期相關,增高的TBX2表達能夠反映組織表型變化和病程進展情況,有助于胰腺癌診斷和預后的判斷。
　　 3、TBX2可能通過STA