1、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的惡性腫瘤，占整個肝癌的70-85％和全世界癌癥死亡原因的第三位。在我國，自20世紀90年代，其已發(fā)展成第二位的癌癥殺手。高死亡率通常與早期診斷和治療選擇的局限性有關。事實上，HCC早期臨床表現(xiàn)的隱蔽性、特異監(jiān)測標志的缺乏和現(xiàn)有治療策略的不足均限制了其預后的進一步改善。而目前即使采取最有效的手術根治性切除，5年的術后復發(fā)轉移率仍超過60％。因此，如何準確的預測

2、預后、降低患者的術后復發(fā)轉移，進行有效的靶向干預治療，已經(jīng)成為亟待解決的問題。
　　大量證據(jù)顯示，HCC是一個典型的炎癥相關的癌癥，主要由于受肝炎病毒感染和肝硬化所致。HCC的慢性炎癥是復雜的腫瘤微環(huán)境的重要組成之一，包括大量炎癥/免疫細胞和介質。因此，在很大程度上，HCC轉移的生物學行為和惡性預后可能被局部的炎癥狀態(tài)所決定和影響。一些證據(jù)提示，在肝癌形成過程中，炎癥/免疫細胞活化，并相互協(xié)作，獲得促瘤活性，從而導致腫瘤的惡性后果

3、。就此而言，這些炎癥/免疫細胞和它們所表達的一些關鍵介質，可能提供了HCC靶向治療的靶點。而值得關注的是，肝星狀細胞(HSCs)活化后，能展示其多變的表型和致纖維化的特性。HSCs在腫瘤微環(huán)境中的作用已經(jīng)開始獲得廣泛關注。有研究認為，在腫瘤微環(huán)境中，HSCs是一種被癌細胞旁分泌因子刺激后，分化為癌相關肌成纖維細胞(CAMFs)的竇周成纖維細胞。一方面，HSCs中的某些活化信號，如轉化生長因子(TGF)-β、肝細胞生長因子(HGF)和血小

4、板源性生長因子(PDGF)在腫瘤發(fā)展和纖維化過程中都起了重要作用。另一方面，HSCs被腫瘤細胞直接誘導活化后，通過腫瘤一間質相互作用的分子網(wǎng)絡，促進血管形成、侵襲和轉移。雖然我們已獲知上述這些關于HSCs在腫瘤發(fā)展中所涉及到的機制，但關于HSCs促進HCC轉移復發(fā)的本質和調節(jié)仍然知之甚少。
　　在本項研究中，我們首先從肝癌微環(huán)境中HSCs的水平，利用組織和基因微陣列技術，比較分析了癌旁HSCs與對應的肝癌CAMFs的全基因表達譜差

5、異，以及幾個最具特征的HSCs的表型標志在HCC組織中的表達水平和患者轉移復發(fā)的聯(lián)系;接著，我們以HSCs基因表達譜的分析結果為基礎，從中篩選出差異表達明顯的炎癥因子，如TREM-1，作為研究對象，探討了其作為功能基因，協(xié)同HSCs促進腫瘤細胞遷徙的機制，并建立了TREM-1與HCC患者預后的關系;最后，通過HSCs基因表達譜，我們發(fā)現(xiàn)了IL-17受體在HSCs中表達。為進一步了解HSCs與炎癥/免疫細胞之間的關系，我們研究了腫瘤活化的

6、HSCs和IL-17+CD4+T細胞之間的相互作用，從而在一定程度上驗證了腫瘤微環(huán)境中各種炎癥/免疫細胞間具有相互“交流”，促腫瘤發(fā)展的作用和能力。
　　第一部分免疫微環(huán)境中腫瘤活化肝星狀細胞的基因表達譜研究
　　本研究旨在通過HSCs的基因譜特征和表型分析，探討其在肝癌局部微環(huán)境中的表型變化、數(shù)目、分布部位和基因表達水平的差異，從而尋找針對HBV相關性HCC的預后和治療靶點有關的有效信息，以進一步研究以HSCs為代表的間質

7、細胞在免疫微環(huán)境和肝癌復發(fā)轉移中所起的作用。
　　本研究中，我們隨機選取224例2007年在復旦大學附屬中山醫(yī)院肝外科行根治性手術切除的HBV相關的HCC患者。首先，我們利用免疫組織化學和細胞定量的方法評價了5個具有代表性的HSCs表型標志在這些患者肝癌組織中的表達水平，包括α-SMA、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、結蛋白(Desmin)、粘著斑蛋白(Vinculin)和波形蛋白(Vimentin);及其和HBV相關的HCC患者術

8、后腫瘤轉移復發(fā)及腫瘤侵襲能力的聯(lián)系;接著，利用流式細胞術，檢測了體外HCC條件培養(yǎng)基(TCM)對HSCs細胞株LX-2的表型變化的影響（GFAP、纖維連接蛋白、CD56和白介素17受體）;最后，我們分別從正常/癌旁肝組織和癌組織中分離出HSCs和癌相關性肌成纖維細胞(CAMFs)，進行全基因表達譜分析。
　　結果發(fā)現(xiàn):(1) Desmin和GFAP在肝細胞癌患者的肝組織中均呈陰性表達;Vinculin和Vimentin則廣泛表達在

9、癌旁和癌內組織的間質和實質細胞中;α-SMA在癌內和癌旁組織中均只在間質細胞中表達，陽性染色細胞形態(tài)不規(guī)則，呈梭型或星型。(2)癌旁α-SMA陽性HSCs的表達水平與腫瘤大小(P=0.015)、腫瘤分化(P=0.002)和TNM分期(P=0.028)正相關;單因素和多因素Cox生存分析均證實，癌旁α-SMA陽性HSCs與HBV相關性HCC患者的至復發(fā)時間(TTR，time torecurrence)和總生存時間(OS，overall s

10、urvival)相關，尤其是對早期復發(fā)和AFP正常的HCC患者具有預測價值（P均＜0.05）;癌旁和癌內的Desmin、GFAP、Vinculin和Vimentin以及癌內α-SMA表達水平與HCC的預后無顯著相關性（OS和TTR的P＞0.05）。(3)經(jīng)3種HCC細胞株（MHCC97L、HCCLM3和HCCLM6）的條件培養(yǎng)基(TCM)刺激后，GFAP+ HSCs細胞株LX-2比例顯著降低(P＜0.05)，而其他表型標志(纖維連接蛋白

11、、CD56和IL-17R)無明顯變化。(4)基因表達譜結果分析，與靜止型HSCs比較，癌旁HSCs和癌內CAMFs均有大量基因發(fā)生顯著上調和下調(P＜0.05)，這些調節(jié)基因多與生物學過程、細胞組成和分子功能有關，并涉及纖維化、炎癥和癌癥發(fā)展有關的信號通路;最后通過選取的一些基因進行實時定量PCR，驗證了該基因芯片的可靠性。
　　以上結果表明，HSCs是構成免疫微環(huán)境中不可或缺的一種炎癥細胞，在炎癥反應和腫瘤微環(huán)境中，其表型和功能

12、基因多變，導致其從靜止狀態(tài)向活化狀態(tài)，直至肌成纖維樣細胞之間的轉變，進而與各種免疫活性細胞和腫瘤細胞相互作用，發(fā)揮其促瘤作用。癌旁活化的HSCs越多，患者預后越差，也說明HSCs在肝癌轉移復發(fā)中的重要作用。通過綜合評價HSCs的基因表達，數(shù)目、分布等，可以準確把握肝癌局部免疫狀態(tài)，也提示其作為有用的HCC風險性生物指標和肝癌免疫靶向治療的潛在價值。
　　第二部分TREM-1在肝星狀細胞中的表達及與肝細胞癌的預后關系研究
　　

13、本研究旨在通過HSCs中表達的炎癥因子TREM-1的研究（通過基因表達譜篩選，見第一部分），探討炎癥細胞與腫瘤預后之間聯(lián)系，并以此為基礎研究腫瘤免疫微環(huán)境中，炎癥細胞通過釋放各種炎癥信號，產(chǎn)生級聯(lián)放大反應，進而動態(tài)調控促炎反應向促瘤方向轉化的機制。
　　本研究中，我們通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)分別檢測了HSCs被LPS或HCC細胞株條件培養(yǎng)基刺激后細胞上清中可溶性TREM-1(sTREM-1)的表達水平，以及總共92例惡性

14、和/或良性肝腫瘤/肝病血漿中可溶性sTREM-1的表達水平;借助免疫組織化學和細胞定量，評估TREM-1在總共240例HCC患者（包括檢測組和驗證組）肝切除組織構建的組織微陣列中的表達情況，通過生存分析，研究了TREM-1陽性細胞的分布、數(shù)目與腫瘤轉移復發(fā)的關系。
　　結果發(fā)現(xiàn):(1) TREM-1在大多數(shù)癌內和癌旁組織均為陽性表達，且在癌細胞和肝細胞的細胞質中表達。免疫熒光和細胞化學也證實其在活化的HSCs和CAMFs中高表達。

15、(2)活化HSCs與HCC細胞株或正常肝細胞株共培養(yǎng)后，細胞上清液中sTREM-1、IL-6和TNF-α的表達水平顯著增加(P＜0.001);LPS刺激30分鐘以后（10μ g/ml-1ng/ml），從HSCs/CAMFs培養(yǎng)上清檢測到增加的sTREM-1水平，活化HSCs/CAMFs分泌sTREM-1的峰值在1-2小時，LPS以時間依賴性的方式，而非劑量依賴性誘導了sTREM-1從活化HSCs/CMAFs中的分泌;(3) TREM-1

16、激動劑/抑制劑誘導HSCs/CAMFs活化后收集的條件培養(yǎng)基，明顯改變了HCC的遷移能力;(4)與良性肝腫瘤比較，HCC患者血清中的sTREM-1、IL-6和TNF-α表達水平顯著增加(P＜0.005);(5)在檢測組中，癌旁TREM-1的密度與血管侵襲(P＜0.001)、腫瘤大小(P=0.001)和TNM分期晚期(P＜0.001)顯著相關;單因素分析顯示癌旁高密度的α-SMA和TREM-1與較短的OS（P均＜0.001）和TTR（P均

17、＜0.001）顯著相關;多因素分析進一步證明，增加的癌旁α-SMA和TREM-1能夠預測患者的OS(P=0.009和0.008)和增加的復發(fā)風險（P=0.015和0.005）。癌旁TREM-1高表達水平更易與早期復發(fā)聯(lián)系在一起（單因素P＜0.001和多因素P=0.006），而不是晚期復發(fā)。驗證組獲得了與檢測組一致的結果，即癌旁高密度的TREM-1與較短的OS(P＜0.001)和TTR(P=0.002)緊密聯(lián)系在一起。
　　以上結果

18、提示，以HSCs為例的間質細胞在免疫微環(huán)境和肝癌的轉移復發(fā)中具有重要的作用。通過它們所表達的一些炎癥信號或通路的作用，發(fā)生級聯(lián)放大反應，擴大微環(huán)境中的炎癥反應，從而進一步強化了腫瘤的惡性生物學行為，促進了癌細胞的侵襲和轉移。TREM-1作為其中的一個炎癥信號，參與了與腫瘤的侵襲行為，可以作為一個潛在的HCC預后預測因素以及抗腫瘤治療中的潛在抗炎靶點。
　　第三部分IL-17/IL-17RE與肝星狀細胞及肝細胞癌預后的關系研究

19、>　　本研究旨在通過研究不同炎癥間質細胞之間（HSCs和Th17）的相互作用，初步探討在腫瘤微環(huán)境中，炎癥信號作為不同炎癥細胞之間“交流”的媒介，并協(xié)同作用，促進腫瘤轉移復發(fā)的可能性，為進一步深入進行各種炎癥細胞與腫瘤細胞之間的調控奠定基礎。
　　通過第一部分中HSCs的基因表達譜，我們證實了幾個IL-17受體（如，IL-17RA、RB和RE）在HSCs中的表達，因而我們選擇了IL-17受體作為研究對象。本研究中，我們通過300例

20、HCC術后切除的組織標本，構建了組織微陣列，利用免疫組織化學和細胞定量的方法，檢測了IL-17和IL-17R(A-E)家族成員的表達情況，并評價了它們對HCC患者預后的預測能力;通過ELISA，檢測了111例HCC患者血清中6個Th17相關性細胞因子（IL-6、-9、-17、-22、-17R和TNF-α）的表達水平;用流式細胞術檢測HSCs條件培養(yǎng)基對IL-17+ CD4+T細胞體外增殖的影響。
　　結果發(fā)現(xiàn):(1) IL-17受

21、體家族成員在各種肝細胞和癌細胞中呈局灶性、分散性和彌漫性表達，顯示出不同的染色模式:IL-17RA和IL-17RB非常相似，在肝組織中的表達呈彌漫性分布;IL-17RC的表達在癌內和癌旁組織均較弱;除了肝實質細胞，IL-17RD和IL-17RE均以相似的染色模式表達在間質細胞;(2)癌旁IL-17RE的密度與血管侵襲(P=0.004)和TNM分期的晚期(P=0.012)相關，沒有臨床病理指標與癌內的IL-17RE和IL-17有關。癌旁和

22、癌內IL-17RE的密度均與TTR和OS顯著相關（P均＜0.001）。癌內的IL-17密度是一個獨立的預測因素。ROC分析表明癌內IL-17RE和IL-17密度組合對于HCC患者的臨床預后的預測價值較單獨指標，更具準確性。二者密度的組合能夠預測早期復發(fā)和晚期復發(fā);(3)在HCC患者血清中，IL-6、-22、-17R和TNF-α表達水平較肝血管瘤患者明顯增加(P＜0.001)，術后5天，所有這些指標的表達水平均顯著降低(P＜0.001);

23、(4)利用癌旁活化HSCs的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，HCC患者和肝血管瘤患者外周血中的IL-17+CD4+和IL17+ CD3+T細胞的比例顯著增加了(P＜0.01)。未刺激的IL-17+ CD4+和IL17+ CD3+T細胞比例無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　以上結果表明，腫瘤微環(huán)境中，各種炎癥細胞之間可能存在相互“交流”，它們分泌或表達的細胞因子或受體為它們構建了聯(lián)系的橋梁。不同類型炎癥細胞之間的協(xié)同作用，可能改變了腫瘤微環(huán)境的

24、穩(wěn)態(tài)，動態(tài)調節(jié)了腫瘤的發(fā)展方向。如同本研究中的IL-17和IL-17RE，是肝癌轉移復發(fā)過程中的重要組成部分，也為我們提供了有用的監(jiān)測高?；颊叩闹笜撕透深A靶點進行靶向治療。
　　結論
　　1基因表達譜分析結果顯示，與靜止型HSCs比較，癌旁HSCs和癌內CAMFs均有大量基因發(fā)生顯著上調和下調，這些調節(jié)基因多與生物過程、細胞組成和分子功能有關，并涉及纖維化、炎癥和癌癥發(fā)展有關的信號通路;
　　2癌旁α-SMA陽性HSC

25、s與HBV相關性HCC患者的TTR和OS相關，尤其是對早期復發(fā)和AFP正常的HCC患者具有預測價值;
　　3 TREM-1在癌細胞、肝細胞和HSCs中表達，癌旁TREM-1的表達水平能夠預測患者的TTR和OS，其高表達水平更易與早期復發(fā)聯(lián)系在一起，而不是晚期復發(fā)。
　　4癌旁和癌內IL-17RE的密度均與TTR和OS顯著正相關。癌內IL-17的密度也是一個獨立的預測因素。癌內IL-17RE和IL-17的密度組合對于HCC患者

26、的臨床預后的預測價值較單獨指標，更具準確性。
　　創(chuàng)新點
　　1首次分析和報道了HCC中癌旁活化的HSCs和癌內CAMFs的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)大量變化的功能基因，通過對這些基因的研究可以準確把握肝癌局部免疫狀態(tài)，也提示其作為有用的HCC風險性生物指標和肝癌多項靶點治療的潛在價值。
　　2首次發(fā)現(xiàn)并報道了TREM-1不僅表達在髓樣細胞中，也表達在肝細胞、肝癌細胞和HSCs中，癌旁TREM-1的表達水平可以作為HCC術后切除

27、轉移復發(fā)的獨立指標，顯示了其作為一個HCC預后預測因素以及抗腫瘤治療中的抗炎靶點的潛在價值。
　　3首次證實癌旁和癌內的IL-17RE在HCC術后患者中的預測能力，并證實了炎癥/免疫細胞之間相互作用促進增殖。
　　潛在應用價值
　　1肝癌腫瘤微環(huán)境中的多種炎癥/免疫細胞（如HSCs和Th17）的密度與患者術后的轉移復發(fā)緊密相關，可以用于作為監(jiān)測HCC風險的生物指標和肝癌靶向治療的靶點。
　　2從肝癌腫瘤微環(huán)境中炎