1、牛梨形蟲(chóng)病(舊稱焦蟲(chóng)病)是由頂復(fù)門、梨形蟲(chóng)綱、梨形蟲(chóng)目中的巴貝斯科(Babesiidae)巴貝斯屬(Babesia)和泰勒科(Theileriidae)泰勒屬(Theileria)的多種原蟲(chóng)寄生于牛的紅細(xì)胞或網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)所引起的一類疾病的統(tǒng)稱,以高熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿或體表淋巴結(jié)腫大為主要特征,嚴(yán)重時(shí)可引起動(dòng)物死亡.本病在我國(guó)分布廣、危害嚴(yán)重,常常給疫區(qū)的養(yǎng)牛業(yè)造成巨大損失. 本研究用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分離保藏的牛梨形蟲(chóng)病病原,包括:5種

2、牛巴貝斯蟲(chóng)(9株)和3種泰勒蟲(chóng)(7株),感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,采集染蟲(chóng)血液,提取基因組DNA,設(shè)計(jì)適當(dāng)引物,利用PCR方法擴(kuò)增核糖體RNA基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITSl-5.8S-ITS2),將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pGEM-Teasy載體,進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定.結(jié)果顯示,巴貝斯蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)核苷酸片段的大小在577bp-750 bp之間,泰勒蟲(chóng)在916-1074bp.用所測(cè)得的ITSl-5.8S-ITS2、ITSl、5.8S和ITS2序列分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),并

3、進(jìn)行同源性比較.結(jié)果顯示:我國(guó)牛的梨形蟲(chóng)可明顯分為泰勒蟲(chóng)和巴貝斯蟲(chóng)兩枝,與傳統(tǒng)分類方法及18S rRNA系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的結(jié)果基本一致.巴貝斯蟲(chóng)的ITSl和ITS2核苷酸區(qū)段變異較大,種間同源性分別在4.4﹪-97.7﹪,有時(shí)甚至超過(guò)種內(nèi)不同地方株之間的關(guān)系,但在ITSl-5.8S-ITS2、ITSl和ITS2序列的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上,牛巴貝斯蟲(chóng)、大巴貝斯蟲(chóng)和牛巴貝斯蟲(chóng)未定種新疆株均自成一枝,雙芽巴貝斯蟲(chóng)與卵形巴貝斯蟲(chóng)共處一枝,位于卵形巴貝斯蟲(chóng)汶川

4、株與卵形巴貝斯蟲(chóng)其它3個(gè)分離株之間;5.8S較保守,種間同源性在61.3﹪.100﹪之間,系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上各種巴貝斯蟲(chóng)的分布與ITSl-5.8S-ITS2、ITSl和ITS2系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)基本一致.泰勒蟲(chóng)ITSl和ITS2區(qū)段種內(nèi)變異較小,種內(nèi)地方分離株之間的同源性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種間同源性;環(huán)形泰勒蟲(chóng)3個(gè)地方株之間ITSl-5.8S-ITS2、ITSl、5.8S和ITS2序列的同源性分別為92.2﹪-94.2﹪、91.2﹪-93.1﹪、97.5﹪-9

5、8.1﹪和92.7﹪-95.3﹪,瑟氏泰勒蟲(chóng)3個(gè)地方株之間4個(gè)核苷酸區(qū)段的同源性分別為97.0﹪-97.9﹪、96.2﹪-97.3﹪、98-7﹪.99.4﹪和97.8﹪-99.3﹪,中華泰勒蟲(chóng)3個(gè)地方株之間4個(gè)核苷酸區(qū)段的同源性分別為98.3﹪-99.6﹪、98.2﹪-99.5﹪、99.4﹪-100.0﹪和97.7﹪-100.0﹪;而環(huán)形泰勒蟲(chóng)與瑟氏泰勒蟲(chóng)4個(gè)核苷酸區(qū)段之間的同源性分別為18.3﹪-35.7﹪、5.4﹪-5.6﹪、95.

6、6﹪-98.1﹪和12.3﹪-14.8﹪,環(huán)形泰勒蟲(chóng)與中華泰勒蟲(chóng)4個(gè)核苷酸區(qū)段之間的同源性分別為18.7﹪-36.5﹪、8.9﹪-11.8﹪、94.9﹪-97.5﹪和9.1﹪-20.7﹪,瑟氏泰勒蟲(chóng)與中華泰勒蟲(chóng)4個(gè)核苷酸區(qū)段之間的同源性分別為54.2﹪-55.3﹪、29.7﹪-33.0﹪、96.2﹪-98.1﹪和61.0﹪-61.7﹪;在所建立的4個(gè)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上,環(huán)形泰勒蟲(chóng)、瑟氏泰勒蟲(chóng)和中華泰勒蟲(chóng)分處于3個(gè)分枝上.該結(jié)果比18SrRNA

7、基因更清楚的揭示:我國(guó)存在三種牛的泰勒蟲(chóng),它們是環(huán)形泰勒蟲(chóng)、瑟氏泰勒蟲(chóng)和中華泰勒蟲(chóng),中華泰勒蟲(chóng)是不同于其它泰勒蟲(chóng)的一個(gè)有效種. 根據(jù)已測(cè)定的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基核苷酸列設(shè)計(jì)牛巴貝斯蟲(chóng)和雙芽巴貝斯蟲(chóng)的特異性引物,建立了一種能夠同時(shí)檢測(cè)牛巴貝斯蟲(chóng)和牛雙芽貝斯蟲(chóng)的多重PCR檢測(cè)方法,且與其它梨形蟲(chóng)病病原沒(méi)有交叉反應(yīng),對(duì)雙芽巴貝斯蟲(chóng)和牛巴貝斯蟲(chóng)混合感染血樣的檢測(cè)敏感性分別可達(dá)到10<'-5>10<'-4>.通過(guò)對(duì)114份人工感染及治療后所