1、目的：初步探討轉(zhuǎn)染4-1BBL基因的小鼠卵巢癌細胞株OVHM細胞在小鼠體內(nèi)的致瘤性及其對免疫功能的影響。 方法：以脂質(zhì)體為載體將重組質(zhì)粒pcDNA3．1和pcDNA3．1/4-1BBL分別轉(zhuǎn)染小鼠卵巢癌細胞株OVHM。設(shè)定藥物濃度梯度，確定Hygro B對OVHM細胞株的最適藥物濃度（800 μg/ml），以此藥物濃度維持培養(yǎng)經(jīng)基因轉(zhuǎn)染的細胞10天后，改為半量藥物繼續(xù)維持培養(yǎng)（400μg/ml），轉(zhuǎn)染成功的細胞逐漸形成單細胞克隆

2、，篩選出抗性單克隆多個，分別培養(yǎng)。采用RT-PCR及流式技術(shù)方法檢測抗性單克隆細胞中目的基因4-1BBL的表達，篩選建立穩(wěn)定高表達4-1BBL的陽性細胞株OVHM/4-1BBL。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組為OVHM/pcDNA3．1（具有Hygro B抗性，但是4-1BBL表達較野生型細胞株沒有增加）。采用計數(shù)法繪制體外培養(yǎng)細胞生長曲線，觀察轉(zhuǎn)染前后細胞體外生長有無變化，以了解基因?qū)毎陨砩L有無影響。本實驗將18只6～8周齡的雌性B6C3F1小鼠

3、隨機分為3組，每組6只小鼠，分別接種OVHM細胞，OVHM/pcDNA3．1細胞，OVHM/4-1BBL細胞于小鼠腹部皮下（1×106/200μl），觀察細胞在各組小鼠體內(nèi)的致瘤性，監(jiān)測各組腫瘤的生長速度及腫瘤體積。于細胞接種后第21天處死各組小鼠，取其瘤體做病理切片H&E染色。無菌操作取其脾臟，制備CTL細胞懸液為效應(yīng)細胞，以野生型OVHM細胞株為靶細胞，以LDH法測定4-1BBL對CTL細胞殺傷活性的影響。 結(jié)果：成功轉(zhuǎn)染O

4、VHM細胞株，建立了高表達4-1BBL基因的OVHM/4-1BBL細胞株。與野生型小鼠卵巢癌細胞株OVHM相比，本實驗所建立的OVHM/4-1BBL細胞株可穩(wěn)定高表達目的基因4-1BBL（IA百分比為77．82±3．45），而OVHM/pcDNA3．1細胞株中4-1BBL基因的表達與野生型OVHM細胞株無顯著性差異（其IA百分比分別為22．56±2．07和21．63±1．61）。轉(zhuǎn)染前后腫瘤細胞的體外生長曲線相似，各細胞體外生長速度無顯

5、著性變化（F=0，P>0．05）。通過小鼠體內(nèi)成瘤實驗發(fā)現(xiàn)OVHM/4-1BBL細胞株在B6C3F1雌性小鼠體內(nèi)的致瘤性較野生型OVHM細胞株和OVHM/pcDNA3．1細胞顯著性降低，且其成瘤時間較晚，腫瘤生長速度顯著減慢（P<0．05），且OVHM/4-1BBL組小鼠均未發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，而其余兩組小鼠均可有腫瘤轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象出現(xiàn)，且兩組小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移無明顯差異。經(jīng)過腫瘤標(biāo)本的病理切片H&E染色可證實，轉(zhuǎn)移瘤體與原發(fā)瘤的同源性。本

6、實驗通過LDH方法測定CTL細胞殺傷活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4-1BBL組小鼠的CTL細胞殺傷活性較其余兩組小鼠有顯著性增強（P<0．05），余兩組小鼠的CTL細胞殺傷活性則無顯著性變化（P>0．05）。 結(jié)論：轉(zhuǎn)染4-1BBL基因?qū)VHM細胞的體外生長沒有明顯影響，但可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生顯著的抗腫瘤免疫，使腫瘤細胞在小鼠體內(nèi)的成瘤性顯著降低，腫瘤生長速度顯著減慢，4-1BBL可以增強CTL細胞的殺傷活性可能與其有關(guān)，有關(guān)具體機制還有待進一步