1、研究背景：
　　硬皮病(scleroderma)是一種細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度合成并沉積于皮膚和內臟器官，造成組織器官纖維化硬化，出現(xiàn)功能障礙的結締組織病。根據有無內臟器官累及，本病分為局灶性硬皮病(localized scleroderma，LS)和系統(tǒng)性硬化(systemic sclerosis，SSc)，其中，系統(tǒng)性硬化又按受累范圍、程度、進展速度及預后等，分為肢端型系統(tǒng)性硬化(li

2、mited cutaneous systemicsclerosis，lcSSc)及彌漫型系統(tǒng)性硬化(diffuse cutaneous systemic sclerosis，dcSSc)。雖然大部分患者病情發(fā)展緩慢，但出現(xiàn)四肢皮膚受累而導致指端反復破潰或關節(jié)功能障礙者，其日常生活和工作則受到嚴重的影響;若累及顏面部皮膚，患者會因美觀受到影響而心理負擔加重。雖然國內外學者對硬皮病的發(fā)病機制及治療進行了大量的研究，取得了較大的進展，但至今仍

3、無特異性藥物治療皮膚硬化，也無法有效控制病情的反復。因此深入研究疾病機制，積極尋找治療硬皮病的新靶點具有重要的社會意義。
　　S100A9是S100鈣結合蛋白家族中的重要一員，主要由髓系來源細胞如單核細胞，中性粒細胞和分化早期的巨噬細胞分泌，與機體固有免疫功能有關。研究發(fā)現(xiàn)S100A9是中性粒細胞的強力趨化劑，能促進各類細胞分泌炎癥因子，在炎癥反應過程中發(fā)揮著重要的作用，與多種炎癥性和自身免疫性疾病關系密切。目前關于硬皮病與S10

4、0A9的研究不多，我們通過基因譜芯片掃描發(fā)現(xiàn)硬皮病模型鼠皮膚組織中S100A9基因表達明顯升高。然而，國內外對S100A9在硬皮病的發(fā)病過程中是否有致病作用，尚未得到公認，值得進一步探討。
　　研究目的：
　　明確硬皮病患者外周血和皮膚組織中S100A9的表達水平，探討其與疾病活動性的關系。
　　觀察S100A9如何參與博來霉素誘導性小鼠皮膚纖維化的發(fā)生發(fā)展，明確S100A9是否具有致纖維化的作用。
　　在硬皮病

5、患者皮膚成纖維細胞中研究S100A9對細胞增殖、炎癥因子分泌及膠原合成的影響，探討S100A9活化成纖維細胞的可能機制。
　　研究內容與方法：
　　第一部分:
　　收集26例局灶性硬皮病患者(LS)、31例肢端型系統(tǒng)性硬化患者(lcSSc)、57例彌漫型系統(tǒng)性硬化患者(dcSSc)和54例正常人的血樣。運用ELISA方法檢測血漿中S100A9的含量，并與患者的臨床實驗室檢查指標進行相關分析;用real-time PCR

6、方法檢測外周血細胞中S100A9的mRNA表達量;免疫組化法測定皮膚組織中S100A9及其相應受體RAGE的表達和分布情況。
　　第二部分:C57BL/6小鼠背部皮下注射不同劑量博來霉素(0.2 mg/ml或0.3 mg/ml，100μl)，每日上午一次，連續(xù)注射三周。取局部病變皮膚組織，用HE染色和Masson特殊染色鑒定小鼠皮膚病變情況，觀察各組小鼠皮膚纖維化程度。構建穩(wěn)定的硬皮病小鼠模型，取造模1、2、3周的小鼠皮膚組織，用

7、real-time PCR和Western blot法檢測皮膚組織中S100A9含量的變化趨勢。
　　每日上午給予小鼠背部皮下注射低劑量博來霉素(0.2 mg/ml，100μl)，每日下午在小鼠皮膚同一部位注射S100A9蛋白(0.5μg)，每日一次，三周后處死小鼠。通過HE染色和Masson特殊染色觀察不同組別小鼠病變皮膚組織病理變化，RT-PCR檢測小鼠皮膚組織中炎癥因子的表達水平，Western blot檢測小鼠皮膚中α-S

8、MA的含量，羥脯氨酸測試法測定皮膚中膠原含量的變化。
　　給予C57BL/6小鼠不同劑量S100A9蛋白(0.1μg，0.25μg，0.5μg)皮下注射，每日一次，連續(xù)三周，通過HE染色和Masson特殊染色觀察S100A9單獨對小鼠皮膚組織的影響，評價皮膚中炎癥因子、α-SMA和膠原表達的變化。
　　第三部分:
　　收集系統(tǒng)性硬化患者病變皮膚組織，分離原代成纖維細胞，用不同濃度S100A9刺激細胞不同時間，分別用CC

9、K8和BrdU法檢測細胞的增殖率;以real-time PCR和ELISA法測定細胞表達炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β和HMGB1的水平;細胞劃痕實驗觀察S100A9對成纖維細胞遷移能力的影響;Western blot評價細胞中膠原、α-SMA、RAGE表達情況以及ERK1/2 MAPK或NF-κB信號通路的活化情況。
　　為了進一步探索S100A9活化成纖維細胞的具體機制，分別應用抗RAGE抗體、抗TLR4抗體、ERK1

10、/2 MAPK通路抑制劑或NF-κB通路抑制劑預先處理細胞，再給予S100A9刺激細胞，檢測細胞增殖率、上述炎癥因子分泌水平和細胞表達膠原、α-SMA、RAGE水平的變化;進一步檢測博來霉素誘導性硬皮病模型鼠的皮膚組織中ERK1/2 MAPK、NF-κB信號通路活化情況，與S100A9處理組相比較，通過體內研究驗證該機制。
　　結果：
　　第一部分:
　　1.與正常對照組相比，dcSSc患者血漿S100A9水平明顯升高

11、。伴有肺部累及或肌肉累及或腎臟累及的dcSSc患者血漿S100A9水平明顯高于無肺部累及或肌肉累及或腎臟累及的患者;抗Scl70抗體或抗組蛋白抗體或抗U1RNP抗體陽性的dcSSc患者血漿S100A9水平均高于上述抗體陰性組患者。
　　2.三種類型硬皮病患者外周血細胞中S100A9 mRNA表達量均高于正常對照組，dcSSc患者S100A9mRNA水平較LS、lcSSc患者顯著升高。
　　3.免疫組化染色顯示硬皮病患者皮膚真

12、皮組織中有大量炎癥細胞浸潤，這些炎癥細胞高表達S100A9;表達S100A9或其受體RAGE的成纖維細胞亦顯著增多。
　　第二部分:
　　1.與生理鹽水組相比，高劑量博來霉素可明顯誘導小鼠背部皮膚纖維化，皮膚厚度增加，膠原沉積增多，低劑量博來霉素不能有效誘導小鼠背部皮膚發(fā)生硬皮病樣改變。高劑量博來霉素造模1、2、3周后，硬皮病模型鼠皮膚組織中S100A9水平逐漸增高，顯著高于生理鹽水對照組。
　　2.將S100A9與低

13、劑量博來霉素同時給藥，發(fā)現(xiàn)S100A9明顯促進低劑量博來霉素誘導小鼠背部皮膚發(fā)生纖維化硬化，皮膚厚度顯著增加，皮膚內炎癥因子、膠原、α-SMA表達增多，兩者協(xié)同的促纖維化效應更強于高劑量博來霉素注射組小鼠。
　　3.與對照組小鼠相比，S100A9皮下注射三周后，可明顯促進小鼠背部皮膚真皮層內炎癥細胞浸潤增多，炎癥因子表達增加;高劑量S100A9處理組小鼠皮膚厚度增厚，低、中劑量S100A9處理組小鼠皮膚厚度改變不明顯。
　　

14、第三部分:
　　1.與對照組細胞相比，S100A9對成纖維細胞有明顯的促增殖作用;S100A9可顯著上調成纖維細胞分泌炎癥因子，并促進細胞表達膠原、α-SMA和RAGE增加;S100A9可活化細胞內的ERK1/2 MAPK和NF-κB信號通路。
　　2.抗RAGE抗體、ERK1/2 MAPK通路抑制劑和NF-κB通路抑制劑可以明顯下調S100A9誘導成纖維細胞增殖和分泌炎癥因子的作用，而抗TLR4抗體對S100A9的刺激無阻

15、斷作用。
　　3.與低劑量博來霉素組相比，S100A9與低劑量博來霉素同時給藥可顯著增強小鼠皮膚組織中ERK1/2 MAPK和NF-κB的磷酸化，并促進受體RAGE在皮膚中的表達。
　　研究結論：
　　1.S100A9在系統(tǒng)性硬化患者血漿和皮膚中表達升高，且血漿蛋白含量與臟器累及和免疫學指標異常有明顯相關性，提示患者體內存在著顯著的炎癥免疫反應異常。
　　2.S100A9蛋白可加重博來霉素誘導的小鼠皮膚纖維化硬化