1、過氧化物酶體增殖物活化受體(peroxisome proliferators—activated receptor，PPAR)γ是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族成員。激活的PPARγ與核內(nèi)的維甲酸X受體結(jié)合形成異源二聚體，再與靶基因的啟動(dòng)子中PPAR反應(yīng)元件相結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。PPARγ主要調(diào)控脂質(zhì)代謝和脂肪細(xì)胞分化，也參與糖類代謝、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞凋亡等病理生理過程。研究報(bào)道PPARγ激

2、動(dòng)劑對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，早期研究顯示在許多血液細(xì)胞中可檢測到PPARγ的表達(dá)，而且在人髓系和淋系白血病細(xì)胞中也可檢測到PPARγ的表達(dá)。盡管大量資料顯示PPARγ激動(dòng)劑具有潛在的抗腫瘤作用，但具體作用機(jī)制尚不十分清楚。最初認(rèn)為PPARγ激動(dòng)劑是通過調(diào)節(jié)PPARγ介導(dǎo)的靶基因的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞增殖。然而近年來有研究表明，在一些腫瘤中PPARγ激動(dòng)劑是通過PPARγ非依賴途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。 Tol

3、l樣受體(Toll—like receptors，TLRs)是天然免疫反應(yīng)中抵抗病原微生物入侵機(jī)體的第一道防線。至今已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物中TLRs家族有11個(gè)成員。每個(gè)TLR都可識別不同的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)。當(dāng)病原體入侵機(jī)體后TLR特異性識別PAMP，通過髓樣分化蛋白88、IL-1受體相關(guān)激酶、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6等各種轉(zhuǎn)接分子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)

4、揮生物學(xué)效應(yīng)。TLR2、4可分布于各種腫瘤細(xì)胞，參與腫瘤免疫監(jiān)視，并對腫瘤的生長發(fā)揮作用。最近研究報(bào)道TLR2、4可以通過NF—к B途徑調(diào)節(jié)干細(xì)胞的增殖與細(xì)胞凋亡。但TLR2、4在K562細(xì)胞中的表達(dá)尚未見資料報(bào)道。 目的：觀察PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮(RGZ)聯(lián)合拮抗劑GW9662對人慢性髓系白血病K562細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響以及對PPARγ和TLR2、4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，探討PPARγ途徑在RGZ誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋

5、亡和生長抑制機(jī)制中的作用，并試圖揭示TLR信號通路在PPARγ非依賴途徑中的作用。 方法：采用人慢性髓系白血病K562細(xì)胞株為靶細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分四組：40μmol/LRGZ組、10μmol/L GW9662組、聯(lián)合用藥組(40μmol/L RGZ+10μmol/L GW9662)、對照組(未加藥)。1.分別用不同濃度的RG2(20-80μmol/L)、GW9662(1，10μmol/L)、40μmol/LRGZ聯(lián)合GW9662(1，

6、10μmol/L)處理細(xì)胞24、48及72小時(shí)后，采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測各組細(xì)胞生長抑制作用。2運(yùn).用瑞氏—姬姆薩染色法油鏡下觀察各組48小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。3.采用Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀分別測定各組24、48、72小時(shí)的細(xì)胞凋亡率。4.PI染色流式細(xì)胞儀分析各組72小時(shí)后對細(xì)胞周期的影響。5.RT—PCR法檢測對照組PPARγ和TLR2、4表達(dá)水平，以及各給藥組24、48、72小時(shí)對PPARγ mRNA表達(dá)的

7、影響。6.采用直接免疫熒光法流式細(xì)胞儀檢測各組48小時(shí)后對TLR2、4蛋白表達(dá)的影響。7.SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，采用單因素方差分析，以P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果：1.MTT結(jié)果顯示：40μmol/L以上的RGZ組較對照組呈時(shí)間、劑量性抑制K562細(xì)胞的生長(P<0.05)；1μmol/L GW9662組較對照組基本上無顯著性差異；40μmol/L RGZ聯(lián)合10μmol/L GW9662組較40μ

8、mol/L RGZ組更顯著的抑制細(xì)胞生長(P<0.05)。2.瑞氏—姬姆薩染色油鏡下觀察，對照組可見K562細(xì)胞形態(tài)均一，胞膜完整，染色質(zhì)分布均勻；40μmol/L RGZ組和10μmol/L GW9662組多可見細(xì)胞體積變小，出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)，染色質(zhì)濃縮、邊緣化等細(xì)胞早期凋亡的改變；聯(lián)合用藥組則可見細(xì)胞核裂解、出現(xiàn)凋亡小體等晚期凋亡的改變。3.FCM檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：40μmol/L RGZ組和10μmol/L GW9662組較對照組

9、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；40μmol/LRGZ聯(lián)合10μmol/L GW9662誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，于72h時(shí)細(xì)胞凋亡率達(dá)50％以上，高于兩種藥物單用時(shí)的凋亡率。4.FCM檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示：40μmol/L RGZ組和10μmol/L GW9662組較對照組G0/G1期細(xì)胞的比例增高同時(shí)S期細(xì)胞比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合用藥組G0/G1期細(xì)胞的比例較單用藥組有所升高。5.RT—PCR顯

10、示：較對照組相比，40μmol/L RGZ組呈時(shí)間性明顯上調(diào)PPARγ表達(dá)，10μmol/L GW9662組對PPARγ表達(dá)無影響，而聯(lián)合用藥組PPARγ表達(dá)較單用RGZ明顯下降。6.直接免疫熒光法顯示：TLR2、4在對照組中表達(dá)的陽性細(xì)胞率分別為(7.91±0.53)％和(83.26±0.34)％；與對照組比較，48h聯(lián)合用藥組及單用RGZ、GW9662組TLR2表達(dá)的陽性細(xì)胞率升高，TLR4表達(dá)的陽性細(xì)胞率下降。 結(jié)論：1.