1、油菜菌核病是一種世界性病害，其病原為核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）。在我國，該病菌寄主范圍非常廣泛，能侵染包括75科278屬400余種植物。目前，油菜菌核病的防治主要以化學防治為主?？┚孀鳛橐环N新型的苯吡咯類殺菌劑對油菜菌核病具有良好的防效，但該藥劑在我國油菜菌核病的防治上尚未進行登記，同時，咯菌腈對核盤菌的作用機制尚不明確。本實驗室已有研究表明，咯菌腈對核盤菌的作用機制與核盤菌的雙組分信號系統(tǒng)有關，而RR

2、G-1和RRG-2是雙組分信號系統(tǒng)中兩個重要的效應調控因子。因此，本文首先系統(tǒng)優(yōu)化了核盤菌原生質體的制備與PEG介導的遺傳轉化體系;然后，利用該體系分別構建了基因敲除突變體及其回復突變體來研究RRG-1和RRG-2的生物學功能，進一步明確RRG-1和RRG-2對咯菌腈敏感性的調控機制。該研究將對油菜菌核病的綜合防控、研發(fā)原創(chuàng)性殺菌劑具有重要意義。
　　1.本文系統(tǒng)優(yōu)化了核盤菌原生質體的制備條件及PEG介導的原生質體遺傳轉化體系。經

3、優(yōu)化，確定制備原生質體的最佳條件為:在25℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中用YEPD液體培養(yǎng)基175 r/min震蕩培養(yǎng)出發(fā)菌株36 h;先用滅菌紗布過濾，滅菌水沖洗2次，再用緩沖液Ⅲ（0.8 M甘露醇的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液）沖洗2次，轉移到含有10mL1.5％酶解液（裂解酶L）的小三角瓶中，30℃85 r/min酶解2.5 h;1200 r/min離心5min收集原生質體，用緩沖液Ⅲ重懸浮，1200 r/min離心5 min; STC重懸浮，12

4、00r/min離心5 min;再用STC重懸浮至原生質體濃度約為108個/μL;取80μL原生質體懸浮液于轉化管中，再加入20μL PTC，冰上放置待用。將含有潮霉素磷酸轉移酶基因（HPH）的片段轉化到核盤菌原生質體后，經100μg/mL潮霉素B篩選轉化子。
　　2.雙組分信號傳導途徑參與調控滲透壓和氧化脅迫、菌絲生長、致病性和殺菌劑抗性等生物學功能。本文利用上述建立的PEG介導的核盤菌原生質體遺傳轉化體系，對核盤菌雙組分信號傳導

5、途徑兩個效應調控因子SsRRG-1和SsRRG-2進行基因敲除及回復驗證，并對其生物學表型進行了分析。結果表明:與親本菌株相比，SsRRG-1基因敲除突變體對SDS、高糖滲透壓、過氧化氫產生的氧化脅迫以及對咯菌腈的敏感性顯著增加，菌絲生長速率顯著降低，菌絲分支增多;致病力顯著下降，細胞膜透性增大，菌核變小且數量增多，SsRRG-1基因敲除突變體胞內甘油含量及對不同金屬離子脅迫的敏感性無顯著性差異。SsRRG-1基因回復突變體的上述表型與

6、親本菌株差異不顯著。
　　與親本菌株相比，SsRRG-2基因敲除突變體對咯菌腈的敏感性降低，對高鹽滲透壓、過氧化氫產生的氧化壓、SDS、剛果紅和Caffine敏感性增加;草酸及胞內甘油含量減少，菌絲頂端扭曲，致病力顯著下降，細胞膜透性增大，不能形成正常的菌核;對不同金屬離子脅迫的敏感度也存在一定差異;qRT-PCR結果表明，SsRRG-2基因敲除后，雙組分信號系統(tǒng)中的下游關鍵激酶基因SsOS4、SsOS5表達量增加，SsHog1表