1、目的：以異基因小鼠皮膚移植為模型，探討供者來源凋亡胸腺細胞輸注誘導同種異體移植物免疫耐受的效應(yīng)、細胞學基礎(chǔ)與分子機制，為設(shè)計防治移植排斥反應(yīng)的新策略提供線索。 方法：用地塞米松誘導供者小鼠（Balb/c，H-2d）胸腺細胞凋亡:采用DNA Ladde凝膠電泳法以及Annexin V/PI細胞染色后流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡；BALB/c小鼠胸腺細胞以PKH67 染色，誘導凋亡后，經(jīng)尾靜脈過繼輸注MHC型別完全不匹配的受者小鼠（C57

2、BL/6，H-2b），12個小時后，取其脾細胞以抗CD11c-PE抗體標記樹突狀細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察樹突狀細胞吞噬凋亡的胸腺細胞；細胞過繼7天后，將BALB/c小鼠皮膚移植給C57BL/6小鼠，觀察移植物存活時間；皮膚移植后7天，取移植皮片，組織學檢測移植物組織中炎性細胞浸潤；混合淋巴細胞反應(yīng)評價供者脾細胞刺激受者小鼠T細胞增殖的作用；RT-PCR檢測受者小鼠脾臟細胞TGF-β、IL-10、Foxp3的mRNA表達水平；流式細胞術(shù)

3、檢測受者小鼠脾臟樹突狀細胞亞類。 結(jié)果： 一、誘導供者胸腺細胞凋亡并過繼輸注，及受者DC吞噬凋亡胸腺細胞的作用1．DNA Ladder 試驗和Annexin V/PI染色檢測證實，地塞米松可顯著增強小鼠胸腺細胞凋亡：經(jīng)地塞米松誘導細胞凋亡率達58.7％，未經(jīng)誘導的胸腺細胞作為對照，在體外培養(yǎng)相同時間凋亡率為32.4％。2．BALB/c小鼠胸腺細胞以PKH67 預先染色，誘導凋亡后經(jīng)尾靜脈輸注至C57BL/6 小鼠體內(nèi)，1

4、2個小時后，取其脾細胞以抗CD11c-PE抗體標記DC，激光共聚焦顯微鏡下可見PKH67+CD11c+，提示凋亡胸腺細胞被DC吞噬。 二、供者凋亡胸腺細胞過繼輸注延長異基因小鼠皮膚移植物存活時間及其機制以BALB/c小鼠為供者，C57BL/6小鼠為受者，進行背部皮膚移植。移植術(shù)前實驗組通過尾靜脈輸注2.5×107供者凋亡胸腺細胞，并以PBS、地塞米松和第三方小鼠（C3H小鼠）作為對照。 1．移植物存活時間供者凋亡細胞過繼

5、輸注，能明顯延長皮膚移植物存活時間：凋亡細胞處理組平均存活時間為17.750±3.956天，PBS組為10.250±1.389天，地塞米松組為15.625±1.685天，C3H組為10.500±1.927天。（n=8，p﹤0.01）。 2．移植皮片組織學檢查移植術(shù)后7天，取移植皮片制石蠟切片，常規(guī)HE 染色，觀察移植物組織中炎性細胞浸潤。與PBS對照組和C3H組相比，凋亡胸腺細胞組移植組織中單個核細胞浸潤明顯減少，未出現(xiàn)毛細血管

6、淤血、間質(zhì)出血、動脈炎和靜脈炎等現(xiàn)象；地塞米松組移植組織中單個核細胞浸潤也比PBS 對照組和C3H組略為減少。 3．受者淋巴細胞增殖功能移植術(shù)后7天，取供者脾細胞再次刺激受者脾臟T細胞，檢測后者對供者同種抗原的再次應(yīng)答能力。結(jié)果顯示：凋亡胸腺細胞組受者脾臟T細胞對供者脾細胞的增殖反應(yīng)顯著低于PBS 對照組和C3H組。 4．受者脾臟細胞因子mRNA表達移植術(shù)后7天，取供者脾細胞和淋巴結(jié)，提取總RNA，借助RT-PCR 檢測

7、TGF-β、IL-10、Foxp3的mRNA表達水平。結(jié)果顯示：凋亡胸腺細胞組脾臟TGF-β、IL-10、Foxp3的mRNA表達水平均較對照組升高，差異有顯著性；地塞米松組脾臟IL-10、Foxp3的mRNA表達水平增高。（p﹤0.05）。 5．受者脾臟中DC亞類檢測移植術(shù)后7天，取供者脾細胞流式細胞術(shù)檢測DC亞類。結(jié)果顯示：凋亡胸腺細胞組CD11c+B220+DC比例顯著增高；凋亡胸腺細胞組和地塞米松組CD11c+CD45R