1、目的:肝細胞癌（HCC）是一種致死率極高的腫瘤，它與慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染關系密切。由于從細胞、分子水平對肝細胞癌發(fā)病機制的研究還不太透徹，所以目前還缺乏治療肝細胞癌的有效措施。因此，深入研究HCC的發(fā)病機制并找到新的治療靶點對HCC的治療至關重要。乙型肝炎病毒X蛋白（Hepatitis B virus X protein,HBx）是由HBV X基因（hepatitis B virus X gene,HBX）編碼的，它對HBV相

2、關HCC的發(fā)生至關重要。Notch信號通路是高度保守的信號通路，依據(jù)腫瘤細胞類型及其它信號通路（如Wnt）的狀態(tài)，Notch信號通路可能在腫瘤的不同階段發(fā)揮相反的作用。前期的研究發(fā)現(xiàn)Notch1信號通路在HBx誘導的人非腫瘤肝細胞系L02的惡性轉化過程中發(fā)揮了必不可少的作用。因此，本課題旨在研究Notch1與Wnt/β-catenin信號通路對HBx致HCC發(fā)生的作用，并且試圖從細胞周期及凋亡調控以及Notch1與Wnt/β-caten

3、in信號通路串話等不同角度探討在此過程中兩條信號通路的關系與作用機制，以期為肝癌的靶向治療提供新思路。
　　方法:通過構建靶向Notch1基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)重組質粒抑制L02/HBx細胞Notch1信號通路，觀察其對細胞增殖及裸鼠體內成瘤的影響。應用流式細胞儀檢測靶向抑制Notch1對L02/HBx細胞周期及凋亡的影響，并用定量RT-PCR及Western blot分別檢測細胞周期及細胞凋亡相關調節(jié)因子的mRNA及蛋

4、白表達水平。另外，用shRNA及過表達質粒的方法分別抑制和上調Wnt/β-catenin信號通路，用定量RT-PCR及Western blot法分別檢測兩條信號通路的關鍵分子及靶基因的表達，同時觀察其對細胞增殖的影響。
　　結果:Notch1 shRNA抑制L02/HBx細胞Notch1信號通路的活性，在體外抑制了細胞增殖及克隆形成，在體內明顯抑制細胞在BALB/c裸鼠皮下的腫瘤形成。而且，阻斷L02/HBx細胞的Notch1，能

5、通過cyclingD1/CDK4通路，下調cyclinD1,CDK4,E2F1,上調p21和Rb，將細胞周期阻滯在G0/G1期，并且通過caspase-9-caspase-3途徑，明顯促進L02/HBx細胞的凋亡。另外，HBx能活化L02細胞的Notch1信號通路和Wnt/β-catenin信號通路，并引起肝細胞的惡性轉化；抑制Notch1信號通路降低L02/HBx細胞中Wnt/β-catenin信號通路的活性，且抑制增殖；抑制Wnt/

6、β-catenin信號通路也能明顯抑制細胞增殖，但對Notch1信號通路沒有明顯的影響；抑制Notch1后上調Wnt/β-catenin信號通路能恢復因抑制Notch1對L02/HBx細胞增殖的抑制作用；而且，在此過程中，Wnt信號通路的膜受體Fzd10的表達水平與Wnt/β-catenin信號通路的活性一致。
　　結論:這些結果提示Notch1信號通路通過cyclingD1/CDK4及caspase-9-caspase-3途徑引