1、研究背景:
　　變應(yīng)性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)是由IgE介導(dǎo)發(fā)生在對變應(yīng)原敏感患者鼻黏膜的炎性疾病,以噴嚏、鼻溢液、鼻充血和鼻癢為主要特征,約60％-70%的患者同時(shí)伴有眼癢、眼紅和/或流淚。盡管沒有生命危險(xiǎn),但變應(yīng)性鼻炎的癥狀常常令人感到焦慮并可能出現(xiàn)身體和精神方面的并發(fā)癥,嚴(yán)重影響患者的工作和生活質(zhì)量,并明顯增加了個(gè)人和社會(huì)的負(fù)擔(dān)。流行病學(xué)研究表明變應(yīng)性鼻炎發(fā)病不斷增加,目前影響約40%的世界人口,近年

2、的研究發(fā)現(xiàn)其不僅是局部疾病也是全身性疾病,特別是與整個(gè)呼吸道疾病密切相關(guān)。上氣道變應(yīng)原刺激不僅導(dǎo)致鼻腔局部的炎癥反應(yīng),也導(dǎo)致了下氣道的炎癥反應(yīng),由于“一個(gè)氣道、一種疾病”,變應(yīng)性鼻炎和哮喘常常共存。研究表明:20%-50%的變應(yīng)性鼻炎的病人有臨床哮喘存在,而>80%的變應(yīng)性哮喘的患者伴隨鼻炎的癥狀。由于上下呼吸道在生理學(xué)、功能和免疫學(xué)方面緊密相連,變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病對哮喘的發(fā)病及病理過程亦產(chǎn)生很大的影響,并且使的整個(gè)呼吸道疾病遷延不愈,因

3、此已經(jīng)變成嚴(yán)重影響公眾健康的疾病。近年來,雖然AR已引起廣泛的關(guān)注及研究,但由于多樣的影響因素及復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制,目前的治療效果尚不完全令人滿意,迫切需要進(jìn)行更深入的研究及尋找新的治療方法。
　　嗜酸性細(xì)胞(Eosinophils,EOS)是多功能白細(xì)胞,在Th2調(diào)節(jié)的變應(yīng)性疾病中起著主要作用,是變應(yīng)性疾病的發(fā)病機(jī)制中的研究重點(diǎn)。此類變應(yīng)性疾病的一個(gè)重是要特征組織內(nèi)EOS大量浸潤。嗜酸性細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)局部免疫和炎癥反應(yīng),激活的嗜酸性細(xì)

4、胞從血液到組織中募集,可以導(dǎo)致包括細(xì)胞因子、趨化因子、脂質(zhì)介質(zhì)和細(xì)胞毒性顆粒蛋白的釋放,這些因子可以觸發(fā)和維持局部靶組織的炎癥和重塑,在免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)和炎癥的發(fā)生中起著重要作用。
　　趨化因子受體3(CCR3)是主要在EOS上表達(dá)的跨膜生成的G蛋白偶聯(lián)受體,通過與嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(Eotaxin)結(jié)合而激活G蛋白依賴的細(xì)胞內(nèi)信號通道而使嗜酸性細(xì)胞祖細(xì)胞和成熟嗜酸性細(xì)胞由骨髓中釋放并誘導(dǎo)他們遷移進(jìn)入特定變態(tài)反應(yīng)性炎癥組織,而此類結(jié)

5、合同時(shí)產(chǎn)生下游信號級聯(lián)放大效應(yīng)并導(dǎo)致炎癥細(xì)胞脫顆粒。因此,CCR3在募集EOS到炎癥組織過程中起著重要作用。
　　RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由外源雙鏈RNA(dsRNA)植入細(xì)胞引發(fā)的一種高效基因表達(dá)抑制途徑,是一個(gè)保守的內(nèi)源性的活動(dòng)能夠用于基因組功能方面的研究。運(yùn)用RNAi,特異性的基因片段被植入細(xì)胞,通過特異性序列的降解和mRNA轉(zhuǎn)錄過程翻譯的干擾,觸發(fā)基因功能的減退而產(chǎn)生基因沉默的作用。RN

6、Ai被發(fā)現(xiàn)以來已顯示出巨大的潛力并獲得了廣泛的應(yīng)用,與傳統(tǒng)藥物比較,運(yùn)用RNAi治療方法能夠抑制各種級別的靶基因的表達(dá),具有高選擇性及優(yōu)勢,提供個(gè)性化的治療,容易合成,并能夠快速識別及優(yōu)化,RNAi正快速成為一種分析真核生物基因功能及通過基因沉默治療疾病的充滿希望的方法。目前,一些體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)對許多疾病運(yùn)用RNAi治療是有效的。而在呼吸道疾病的應(yīng)用中也已進(jìn)行了一些研究,盡管運(yùn)用siRNAs治療呼吸道疾病的給藥方式有多種途徑,

7、但主要集中在通過支氣管或鼻腔內(nèi)給藥。這種直接給藥的途徑需較低劑量的siRNAs,減少了不良的全身副作用,由于氣道內(nèi)核酸酶活性較低因而提高了siRNA的穩(wěn)定性,針對呼吸道疾病更有效。而鼻腔途徑更有優(yōu)勢,這在一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已得到證實(shí)。
　　嗜酸性粒細(xì)胞在鼻黏膜中大量浸潤是變應(yīng)性鼻炎的重要病理學(xué)特征。目前的研究亦認(rèn)為這同時(shí)是變應(yīng)性鼻炎的一個(gè)重要發(fā)病環(huán)節(jié),因此,治療變應(yīng)性鼻炎疾病過程的重要方面即抑制嗜酸性粒細(xì)胞局部浸潤和活化,這將有助于對

8、變應(yīng)性疾病發(fā)病的控制。
　　當(dāng)前,運(yùn)用RNAi沉默CCR3對變應(yīng)性鼻炎嗜酸性細(xì)胞作用過程全程(從骨髓嗜酸性祖細(xì)胞的募集、遷移到嗜酸性細(xì)胞的凋亡)影響進(jìn)行研究目前尚未見報(bào)道,而運(yùn)用RNAi沉默CCR3對變應(yīng)性鼻炎的治療效果的研究目前國內(nèi)外尚不多見。
　　因此,本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?jīng)鼻腔運(yùn)用RNAi沉默CCR3在嗜酸性細(xì)胞上的表達(dá),通過阻斷Eotaxin/CCR3路徑的作用分析、了解并觀察其對嗜酸性細(xì)胞凋亡過程的影響及嗜酸

9、性細(xì)胞在骨髓、外周血及局部組織的募集、遷移及成熟過程的機(jī)制變化,以期全面了解變應(yīng)性鼻炎嗜酸性細(xì)胞在此干擾過程中的變化及影響,為變應(yīng)性鼻炎的基因治療尋找新的靶點(diǎn)及方法。
　　第一部分L小鼠CCR3RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　目的:
　　構(gòu)建小鼠CCR3基因RNA干擾慢病毒表達(dá)載體,并評估其對嗜酸性細(xì)胞CCR3沉默作用。
　　方法:
　　針對小鼠CCR3基因序列,設(shè)計(jì)出RNAi靶點(diǎn)序列,同時(shí)合成靶序列的

10、Oligo DNA,經(jīng)退火處理后形成雙鏈DNA,再與由MluI、SacⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切后形成的pLVX-shRNA2-m載體連接產(chǎn)生短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒載體。以shRNA慢病毒載體進(jìn)行293T細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞轉(zhuǎn)染后測定病毒滴度,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)檢測嗜酸粒細(xì)胞中CCR3mRNA的表達(dá)情況和蛋白印跡法(western blot)檢測CC

11、R3的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　shRNA-mCCR3慢病毒載體成功進(jìn)行構(gòu)建,并與設(shè)計(jì)合成的靶向鏈測序完全一致。利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)293T細(xì)胞的感染效率>90%,而病毒滴度的檢測結(jié)果為4X108TU/ml;運(yùn)用Q-PCR及western blot檢測結(jié)果顯示嗜酸性細(xì)胞CCR3基因沉默效率達(dá)到86.7%而CCR3的蛋白表達(dá)明顯減低。
　　結(jié)論:
　　CCR3基因RNAi慢病毒表達(dá)載體被成功構(gòu)建,而且有

12、較高的嗜酸性細(xì)胞CCR3基因沉默效率,為后續(xù)通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步了解其對EOS的影響及在變應(yīng)性鼻炎發(fā)病機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分:慢病毒介導(dǎo)的RNAi沉默CCR3對變應(yīng)性鼻炎嗜酸性細(xì)胞影響實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:
　　運(yùn)用經(jīng)體外合成的以慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi經(jīng)鼻腔沉默CCR3基因表達(dá),觀察變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻腔黏膜病理變化及在骨髓、外周血、鼻腔灌洗液中嗜酸性細(xì)胞比例變化。觀察變應(yīng)性鼻炎小鼠在骨髓、外周血及鼻腔

13、灌洗液(鼻黏膜)中嗜酸性細(xì)胞CCR3基因mRNA及蛋白的表達(dá)變化、嗜酸性細(xì)胞顆粒蛋白變化。觀察在體外培養(yǎng)嗜酸性細(xì)胞感染合成的慢病毒載體后對EOS凋亡的影響。進(jìn)而評價(jià)其對變應(yīng)性鼻炎發(fā)病機(jī)制的影響并評估該基因治療方法在變應(yīng)性鼻炎中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:
　　將CCR3siRNA重組穿梭質(zhì)粒(pLVX-ShRNA2-mCCR3-1+2+3+4)經(jīng)鼻腔局部給藥方法應(yīng)用于小鼠過敏性鼻炎動(dòng)物模型上,經(jīng)HE染色、瑞氏染色檢測實(shí)驗(yàn)小鼠鼻黏

14、膜病理變化及骨髓、外周血、鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞比例的改變。以逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測實(shí)驗(yàn)小鼠骨髓、外周血及鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞CCR3及顆粒蛋白mRNA的表達(dá)變化。Western blot檢測骨髓、外周血及鼻腔粘膜CCR3基因蛋白表達(dá)變化。TUNEL檢測體外培養(yǎng)嗜酸性細(xì)胞凋亡在CCR3基因靶向干擾下的變化。
　　結(jié)果:
　　(1):HE染色顯微鏡觀察變應(yīng)性性鼻炎小鼠鼻黏膜水腫、上皮脫落、黏膜下血管擴(kuò)

15、張,并可見大量的炎性細(xì)胞浸潤,與正常對照組相比較嗜酸性粒細(xì)胞明顯多,經(jīng)CCR3siRNA治療后,可見鼻腔黏膜水腫減輕、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少。
　　(2):瑞氏染色觀察,計(jì)數(shù)顯示血液、骨髓、鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞比例均比正常對照組高,經(jīng)CCR3siRNA治療后,嗜酸性粒細(xì)胞比例下降。
　　(3):CCR3siRNA治療組CCR3mRNA在骨髓、外周血及鼻腔灌洗液中表達(dá)低于PBS治療對照及siRNA治療對照組(P<0.05

16、)。
　　(4):CCR3siRNA治療組的嗜酸性粒細(xì)胞顆粒蛋白:主要堿性蛋白(MBP)、陽離子蛋白(ECP)及過氧化物酶(EPO)的mRNA在骨髓、外周血、鼻腔灌洗液中表達(dá)均低于PBS治療對照及siRNA治療對照組(P<0.05)。
　　(5):在實(shí)驗(yàn)小鼠骨髓、外周血、鼻腔黏膜中,CCR3siRNA治療組的CCR3基因蛋白表達(dá)低于PBS治療對照及siRNA治療對照組(P<0.05)。
　　(6):TUNEL檢測結(jié)果表

17、明,與對照組相比較,嗜酸性粒細(xì)胞感染shRNA-mCCR3慢病毒顆粒后其凋亡率增加。
　　結(jié)論:
　　(1)經(jīng)鼻腔進(jìn)行針對CCR3基因RNAi技術(shù)的靶向治療可減輕變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型中鼻黏膜變態(tài)反應(yīng)過程并減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨髓、外周血及鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量。
　　(2)經(jīng)鼻腔進(jìn)行針對CCR3基因RNAi技術(shù)的靶向治療可抑制變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型中嗜酸性粒細(xì)胞的發(fā)育、遷移及浸潤過程,減少嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒作用而減輕變應(yīng)性鼻炎