1、細菌編碼的三型分泌系統(tǒng)(T3SS)通常是致病性和毒力的根源。適當?shù)沫h(huán)境因素可激活T3SS編碼基因的表達，從而啟動了結合在雙層細胞膜上的巨大針狀復合物的組裝以及各種效應蛋白的運輸。T3SS分泌的效應蛋白包括大量的毒力因子。這些毒力因子可通過針狀復合物直接輸送至宿主細胞內(nèi)，從而發(fā)揮裂解細胞，干擾細胞功能等作用，最終產(chǎn)生致病。因此，T3SS被認為是抗毒力類抗感染藥物設計的理想靶標。
　　T3SS組裝的針狀復合物的核心元件之一是高度保守的

2、ATPase，T3SS ATPase組裝成環(huán)狀同源六聚體，位于針狀復合物的基底。其功能包括效應蛋白的識別，并利用ATP水解的能量將效應蛋白運輸至針狀復合物的中央隧道，實現(xiàn)向胞外的分泌。以往的研究表明，T3SS ATPase具有和F-type或V-type ATP合成酶高度同源的空間結構，因此暗示了T3SS ATPase使用與F-type或V-type ATP合成酶相似的機制驅動蛋白質底物的輸送。為證明這一假說，結構生物學研究揭示了T3S

3、S ATPase單體具有和ATP合成酶異源六聚體中β亞基相似的拓撲結構，然而由于T3SS ATPase高度的不穩(wěn)定性，六聚體的結構始終缺乏高分辨率結構數(shù)據(jù)支持。T3SS ATPase六聚體組裝的唯一實驗證據(jù)來自HrcN蛋白的電鏡研究。然而基于分辨率的局限，電鏡結構無法提供六聚體組裝，NTP結合及底物運輸?shù)冉Y構細節(jié)。
　　為揭示三型分泌系統(tǒng)ATPase底物結合的特異性以及其參與效應蛋白輸出的分子機制，本課題結合結構生物學、生物物理及

4、生物化學和細菌學等多學科手段對痢疾桿菌T3SS ATPase Spa47及沙門氏菌T3SS ATPase InvC進行了系統(tǒng)的研究。首先，通過等溫滴定的方法(ITC)測量了Spa47及InvC特異性結合不同核苷酸ATP，AMPPNP，ATPγS和ADP的能力。發(fā)現(xiàn)ATPγS的結合活性最接近天然底物ATP的結合活性，然而廣泛使用的ATP類似物AMPPNP的結合能力僅與產(chǎn)物ADP的結合能力相當。為了進一步揭示T3SS ATPase的底物識別

5、特異性的結構基礎，我們分別解析了缺失N-端膜結合區(qū)和β-barrel結構域的Spa47和InvC的晶體結構及其與各種不同核苷酸形成的復合物晶體結構，分別為Spa47Δ1-83-ATPγS，Spa47Δ1-83-AMP-PNP, Spa47Δ1-83-ADP和 InvCΔ1-83-ATPγS,InvCΔ1-83-AMP-PNP，InvCΔ1-83-ADP。晶體結構分析揭示Spa47和InvC由典型的α/β Rossmann fold和C端

6、螺旋束(helical bundle)結構域組成，與其他T3SS ATPase結構相似，驗證了這類ATPase在結構上的保守性和酶學活性機制的相似性。在T3SSATPase與核苷酸結合的復合物結構中，僅有ATPγS和輔酶鎂離子與Spa47或InvC的活性中心完全結合，因而揭示了T3SS ATPase識別ATP的結構基礎。Apo T3SSATPase與各種核苷酸復合物晶體結構的比對分析確定識別ATP關鍵分子間作用力為P-loop與連接β和

7、γ磷酸集團之間氧原子的氫鍵。由于在AMPPNP中β和丫磷酸集團之間氧原子被氮原子取代，不支持氫鍵的形成，這些發(fā)現(xiàn)解釋了AMPPNP的結合能力與缺失γ磷酸集團的ADP類似。通過對Spa47和InvC結合ATPγS復合物晶體結構的深入分析，我們進而發(fā)現(xiàn)核苷酸的結合引起了一系列位于活性中心的構象變化，這種構象變化繼而傳導至下游的β9-α8 loop。β9-α8 loop位于T3SS ATPase六聚體中央隧道內(nèi)部，直接參與了效應蛋白的運輸。<

8、br>　　綜上所述，本研究首次解析了T3SSATPase與核苷酸和催化鎂離子復合物的晶體結構，提供了識別ATP的結構基礎。我們的結果確定了T3SS ATPase識別核苷酸的關鍵位點，為核苷酸類抑制劑設計提供了依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)了ATP結合引起的構象變化可導致參與效應蛋白輸送的β9-α8 loop的構象變化，從而暗示了ATP水解活性與效應蛋白輸送之間的關聯(lián)，為了解T3SSATPase功能機理提供了線索。三型分泌系統(tǒng)是細菌毒力研究的核心科學問