1、胰腺纖維化是與慢性胰腺炎(chronic pancreatitis)相伴隨的特殊的組織病理學特點，往往導致胰腺功能性組織喪失，富含連接組織的細胞外基質(extracellular matrix ECM)在胰腺內沉積等后果。然迄今為止，胰腺纖維化過程精確的調控機制仍未明了。 胰腺星狀細胞(pancreatic Stellate cell，PSC)是產生胰腺纖維化的關鍵細胞，并最終導致慢性胰腺炎的形成。在此過程中有多種細胞因子參與，

2、而各種因子的產生途徑、相互作用機制不盡相同。激活素(Activin)最早是在性腺發(fā)現的糖蛋白激素，后來發(fā)現其作用不僅限于性腺，具有多種生物學功能，屬于TGF-β超家族的成員，其三種受體屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。激活素參與機體炎癥反應和組織修復過程，一定水平激活素不但呈劑量依賴性的促進PSC增殖并表達a平滑肌肌動蛋白(a—SMA)，而且可增強其膠原蛋白分泌。內皮素(endothelin ET)作為迄今所知最強的縮血管物質，其作用機制是通

3、過增加PSC的膠原合成和分泌，以及提高PSC的攝取與合成能力有關。整合素(Integrin)是位于細胞表面的糖蛋白受體家族分子，為介導細胞—細胞以及細胞—細胞外基質，且作為介導信號傳遞的膜分子，在許多重要的病理生理過程：如細胞增殖、分化、伸展和遷移、凋亡、炎癥反應、組織修復和腫瘤侵襲轉移等中起著十分重要的作用。 細胞因子在促進PSC活化、增殖、遷徙過程中，都要通過細胞信號傳導通路對PSC進行控制。C—Jun氨基端激酶(c—Jun

4、-Terminal kinase，JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen—activaed proren kinase，MAPK)信號傳導通路家族成員。MAPK廣泛參與細胞的多種生命過程，包括生長、分化、細胞周期調節(jié)，腫瘤發(fā)生，細胞凋亡等。JNK主要參與ECM的合成。 漢丹肝樂是在臨床辯證的基礎上，以丹參、黃芪、漢防己堿、銀杏、赤芍等五味中藥組方而成。已有的研究證實，它可通過減輕肝細胞脂質過氧化、保護肝細胞、抑制HSC增殖

5、及膠原合成、提高膠原酶活性、并促進膠原蛋白降解等多種機制，來發(fā)揮抗肝纖維化效應。 本課題采用細胞生物學和分子生物學技術(包括免疫組化、RT-PCR，western blot等)，檢測激活素、整合素、內皮素在胰腺組織損傷修復及纖維化形成過程中的動態(tài)變化以及應用藥物干預胰腺纖維化的形成。旨在探討激活素、整合素、內皮素在慢性胰腺炎胰腺纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用和細胞內傳導途徑以及藥物干預效果。本課題主要分為三部分：(1)慢性胰腺炎大鼠模

6、型的建立；(2)激活素、整合素、內皮素在慢性胰腺炎胰腺組織中的表達；(3)漢丹肝樂對大鼠慢性胰腺炎胰腺纖維化干預的研究。 實驗方法： 1、實驗動物模型的建立 通過向Wistar大鼠膽胰管輸注含2％—硝基苯磺酸(TNBS)的10％乙醇PBS溶液復制慢性胰腺炎動物模型，在膽胰管中注射等量的10％乙醇PBS溶液復制對照組，干預組(模型組動物)術后第三天給予口服漢丹肝樂，大鼠術后分1、2、3、4、5、6、7周等觀察時點。

7、 2、實驗標本的制備 抽取血清分別應用速率法、電化學發(fā)光免疫法測定血清淀粉酶及C肽；取胰腺組織部分即刻按透視電鏡觀察胰腺組織超微結構要求制片后行電鏡觀察，部分胰腺組織行組織學標本制備，部分胰腺組織—80℃保存。 3、免疫組化 組織學標本經脫蠟、脫苯，水化后采用免疫組化法檢測FN膠原、ACT—A、ET—1、Integrinα5β1、JNK、a—SMA，結果判定：光鏡下胰腺間質出現黃、棕色為陽性染色。免疫組化

8、半定量分析表達程度：應用彩色圖象分析系統(tǒng)，對各組大鼠胰腺切片隨機選取10個視野測量，計算陽性染色面積占胰腺視野面積比，并進行定量分析，以染色面積在標本中所占百分比表示。 4、Masson膠原染色 組織學標本經脫蠟、脫苯，水化后采用采用Masson膠原染色法行胰腺組織膠原染色，結果判斷：胰腺腺泡呈紅色，膠原纖維呈藍色或綠色。膠原面積半定量分析：選取每一例標本10個不同視野下相同大小的區(qū)域，測算出膠原面積占該區(qū)域的百分比，取

9、其平均值作為膠原的相對含量值。 5、RT-PCR RT-PCR技術檢測模型組激活素mRNA、整合素mRNA、內皮素mRNA的表達。實驗所用物品的去Rnase處理，組織總RNA的提取，逆轉錄(RT)反應，聚合酶鏈反應(PCR)，基因擴增產物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，拍照。結果分析：將凝膠電泳圖像輸入，自動電泳凝膠成像分析系統(tǒng)，進行表達強度分析，按下公式計算相對系數：相對系數=細胞因子表達強度/β—actin表達強度。每

10、張電泳圖重復進行3次，計算均數。 6、western blot(蛋白印跡) western blot法檢測α—SMA、JNK表達。組織中總蛋白的提取，聚丙稀酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉膜，印跡(blotting)，將膠片圖像輸入凝膠成像分析系統(tǒng)，進行表達強度分析，按下公式計算相對系數：相對系數=蛋白表達強度/β—actin表達強度，每張圖像重復進行3次，計算均數。 結論： 1、膽胰管內注射2％T

11、NBS乙醇PBS溶液的方法成功復制慢性胰腺炎的動物模型。 2、本方法可反映急性胰腺炎向慢性胰腺炎轉化的動態(tài)過程，符合人類慢性胰腺炎病情演變的規(guī)律。本方法造模后4周，即可滿足研究需要。 3、激活素、整合素、內皮素可促進慢性胰腺炎發(fā)生纖維化過程。 4、激活素促慢性胰腺炎胰腺纖維化的作用主要發(fā)生在病程的后期，整合素、內皮素促慢性胰腺炎胰腺纖維化的作用主要發(fā)生在病程的早、中期。 5、漢丹肝樂具有抑制大鼠慢性胰腺炎