1、糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種多病因引起的內(nèi)分泌代謝疾病，是由胰島素分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂，其特點(diǎn)是慢性高血糖。糖尿病的根本危害在于其各種并發(fā)癥，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是其重要的慢性并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致糖尿病晚期死亡的主要原因。研究糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制，探討葡萄子原花青素(grape seed proanthocyanidinextrac

2、ts，GSPE)對(duì)糖尿病大鼠心肌的保護(hù)機(jī)制，對(duì)延緩糖尿病心肌病的病理進(jìn)程，改善預(yù)后，降低死亡率有重要的臨床意義。 糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制包括：糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)途徑、多元醇途徑、蛋白激酶C(PKC)激活途徑、己糖胺途徑和氧化應(yīng)激等。高糖情況下，以上機(jī)制共同作用，引起一系列病理變化。其中AGEs途徑仍為研究重點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)研究水平的提高，非酶糖化研究不斷深入，AGEs、糖基化終末產(chǎn)物的受體(receptor for

3、 advanced glycaton end products，RAGE)、核因子k B(neuclearfactor kappaB，NF-k B)及多種細(xì)胞因子、炎癥因子的發(fā)現(xiàn)，其相互之間的復(fù)雜聯(lián)系在誘發(fā)和促進(jìn)糖尿病并發(fā)癥，尤其是糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展中的作用，越來(lái)越受到人們的重視。AGEs發(fā)揮作用的一個(gè)重要途徑便是通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞膜上的特異受體RAGE結(jié)合，引起細(xì)胞因子、激素、氧自由基等可溶性物質(zhì)含量的改變，導(dǎo)致多種蛋白基因表

4、達(dá)水平的改變，參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，引發(fā)一系列代謝紊亂，這可能是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的關(guān)鍵途徑?？筊AGE抗體或sRAGE阻斷AGEs與RAGE相互作用能逆轉(zhuǎn)糖尿病心血管并發(fā)癥的進(jìn)展。GSPE是從葡萄子中提取的多酚類化合物，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，還具有抗動(dòng)脈硬化和調(diào)節(jié)血脂等作用，對(duì)糖尿病大鼠心肌損害方面的干預(yù)研究，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立糖尿病大鼠模型，運(yùn)用GSPE進(jìn)行干預(yù)，采用透射電鏡、HE、PAS、MASSON染色、免疫組織化學(xué)及R

5、T-PCR等方法，同時(shí)測(cè)定血漿中．AGEs等指標(biāo)，從蛋白質(zhì)和基因水平上探討糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制和觀察GSPE對(duì)糖尿病大鼠心肌病的干預(yù)效果，并探討其作用機(jī)制。 目的：本研究通過(guò)鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠動(dòng)物模型，應(yīng)用GSPE進(jìn)行治療干預(yù)，在此基礎(chǔ)上，觀察24周，旨在探討糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制，研究GSPE對(duì)糖尿病心肌病的干預(yù)作用。 方法：雄性Wistar大鼠尾靜脈注射0.1﹪STZ以建立

6、糖尿病模型，成模后隨機(jī)分為2組，糖尿病對(duì)照組(DM1組，n=8)和糖尿病GSPE治療組(GSPE250mg/kg/d，DM2組，n=12)，另設(shè)2組，正常對(duì)照組(C1組，n=10)和正常GSPE治療組(GSPE 250mg/kg/d，C2組，n=10)。觀察24周后，處死大鼠，采血測(cè)空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、糖化血紅蛋白(glycosylatedhemoglobin，HbAlc)、AGEs等指標(biāo)；

7、對(duì)各組進(jìn)行HE、PAS、MASSON染色，觀察糖尿病大鼠心臟組織的病理改變；應(yīng)用透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)改變；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察RAGE、核因子-κB(neuclear factor kappaB，NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β<,1>(transforming growth factorβ<,1>，TGF-β<,1>)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)在心臟組織中的表達(dá)情

8、況；半定量PT-PCR方法檢測(cè)大鼠心臟組織RAGE、NF-κB、TGF-β<,1>和CTGF基因表達(dá)情況。 結(jié)果： 1．一般觀察：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，DM1組大鼠呈現(xiàn)明顯多尿、多飲、多食及消瘦，皮毛污穢無(wú)光澤，生長(zhǎng)緩慢；DM2組糖尿病大鼠上述表現(xiàn)減輕，C 1組、C2組大鼠無(wú)糖尿病表現(xiàn)，生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)狀況良好。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始4組大鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，C1、C2組體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DM1、DM2組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DM

9、1組比C1組體重明顯下降(P<0.001)。C1組與C2組肝腎功能差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DM1組和DM2組相比，F(xiàn)PG、HbAlc差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；FPG、HbAlc在DM1組比C1組明顯升高(P<0.001，P<0.001)。 2．血清AGEs濃度測(cè)定：24周后AGEs在DM1組比C1組和DM2組明顯升高。 3．心臟組織病理改變： (1)HE、PAS、MASSON染色發(fā)現(xiàn)：C1組和C2組心肌纖維無(wú)肥大，細(xì)胞核呈圓形

10、或橢圓形，居于細(xì)胞中央，心肌間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常；心肌纖維結(jié)構(gòu)正常，心肌組織中無(wú)明顯PAS陽(yáng)性物質(zhì)沉積：心肌膠原纖維分布均勻。DMl組心肌細(xì)胞肥大，深染，邊界不清，細(xì)胞核大小不均勻。心肌纖維有局灶性壞死，可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。心肌纖維中PAS陽(yáng)性物質(zhì)多見(jiàn)。心肌膠原纖維分布不均勻，排列紊亂，相互連接成網(wǎng)狀。以上改變?cè)贑1組、C2組和DM2組大鼠心肌纖維中少見(jiàn)。 (2)免疫組織化學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，RAGE、NF-KB、TGF-β<,1>和CTGF在D

11、Ml組心肌組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)，DM2組表達(dá)明顯減弱，在C1組和C2組中只有輕微的表達(dá)。 4．心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，電鏡下觀察各組大鼠心肌組織切片。C1組：心肌細(xì)胞核形規(guī)則，異染色質(zhì)較少；肌原纖維和線粒體排列有序，線粒體嵴豐富；閏盤結(jié)構(gòu)正常；基膜與心肌細(xì)胞膜完整。C2組：肌原纖維和線粒體排列有序，線粒體嵴豐富，T小管和肌漿網(wǎng)無(wú)腫脹。DMl組：心肌細(xì)胞核周池腫脹；胞質(zhì)和核周出現(xiàn)高電子密度脂質(zhì)顆粒；肌原纖維和線粒體排列紊亂

12、，線粒體大小及形狀不一，肌漿網(wǎng)輕度腫脹；閏盤結(jié)構(gòu)輕度異常。DM2組：心肌細(xì)胞核形較規(guī)則，染色質(zhì)分布尚可，核周無(wú)腫脹；閏盤結(jié)構(gòu)正常；肌原纖維排列尚規(guī)則，肌膜外基膜完整；部分線粒體大小不一，腫脹。異常結(jié)構(gòu)較：DMl組明顯改善。 5．PT-PCR結(jié)果：實(shí)驗(yàn)大鼠心肌組織基因表達(dá)檢測(cè)中，RAGE、NF-KB、TGF-β<,1>和CTGF mRNA在DMl組表達(dá)水平明顯升高，DM2組各基因表達(dá)水平明顯降低。RAGE、NF-KB、TGF-β<

13、,1>和CTGF mRNA電泳帶光密度的圖像處理分析結(jié)果顯示DMl組心肌組織基因RAGE/GAPDH、NF-KB/GAPDH、TGF-β<,1>/GAPDH、CTGF/GAPDH相對(duì)值明顯高于C1組，經(jīng)GSPE治療后，各相對(duì)值比DMl組顯著降低。 結(jié)論： 1．AGEs/RAGE和NF-KB參與了糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展； 2．GSPE可以通過(guò)阻斷AGEs/RAGE/NF-KB的結(jié)合效應(yīng)對(duì)糖尿病大鼠心肌起到保護(hù)作用

14、： (1)GSPE可以改善糖尿病大鼠心臟病理學(xué)形態(tài)； (2)GSPE可以改善糖尿病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)； (3)GSPE可以降低糖尿病大鼠心臟TGF-β<,1>和CTGFmRNA表達(dá)水平，參與抑制糖尿病大鼠心肌纖維化的過(guò)程，減輕其心肌損害。 3．葡萄子原花青素為天然植物成分，本研究為預(yù)防和治療糖尿病心肌損害的新藥研發(fā)提供了重要的理論參考依據(jù)。 意義： 本研究發(fā)現(xiàn)，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠動(dòng)物模型中，糖

15、代謝異?？梢餉GEs的升高，AGEs發(fā)揮作用的一個(gè)重要途徑就是通過(guò)與心肌細(xì)胞上的特異性受體RAGE結(jié)合，誘導(dǎo)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活NF-kB，引起心肌細(xì)胞中細(xì)胞因子TGF-β<,1>、CTGF的表達(dá)增加，導(dǎo)致大鼠心肌的損傷，促進(jìn)糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展。GSPE具有多種生物學(xué)特性，它可通過(guò)阻斷AGEs/RAGE的結(jié)合效應(yīng)，阻斷NF-kB和RAGE介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，改善糖尿病大鼠心肌的損害。GSPE為天然植物成分，本研究為預(yù)防和治療糖