1、近年來，內皮細胞（ECs）的研究與應用價值受到科學家的廣泛關注，對內皮細胞或內皮祖細胞發(fā)育分化調控機制及其應用價值的研究日益拓展和深入。內皮祖細胞（EPCs）作為血管內皮的前體細胞，在一定的條件下可以增生并分化為血管內皮細胞，從而有望在很多臨床治療中扮演重要角色。但內皮祖細胞來源非常有限，其只占外周血單個核細胞的0.02-0.1％。人胚胎干細胞（hESCs）為目前最為重要的再生醫(yī)學種子細胞之一，與其他干細胞相比具有更強的增殖能力、多能性

2、及低免疫原性，由hESCs誘導分化為EPCs有望成為我們獲得EPCs或者是內ECs的重要來源。但是，hESCs向ECs總體分化效率不高，如何獲取足夠數量的有功能的ECs仍是當前面臨的最大挑戰(zhàn)。除此之外，hESC體外向EPCs/ECs的分化亦為研究內皮細胞的生物學特性以及內皮細胞發(fā)育分化的調控機制提供了不可多得的模型。
　　 內皮細胞像一把雙刃劍，不僅在再生醫(yī)學中具有非常重要的價值，其本身的增殖又與異常血管發(fā)育、惡性腫瘤等多種疾病

3、的發(fā)生與發(fā)展密切相關。目前，探討血管內皮細胞在生理和病理狀態(tài)下的增殖發(fā)育與功能發(fā)揮的調控機制，從而開展以血管內皮為靶標的治療受到越來越多的關注，如VEGF在惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展中的作用日益明確，VEGF抗體的臨床價值受到廣泛肯定。研究表明，作為實體腫瘤顯著生理學特征的低氧是VEGF重要誘導因素之一，而低氧的生物學作用無疑主要是通過低氧誘導轉錄因子（HIF）介導完成的。那么，HIF在血管內皮增殖及其生物學功能的發(fā)揮中扮演怎樣的角色是值得關注

4、的問題。HIF家族中最重要的一個成員是HIF-1，其活性主要與α亞基有關。內皮細胞中HIF-1α被抑制之后，腫瘤細胞的生長與浸潤等生物學活性是否受到影響，如果是，HIF-1α又是通過怎樣的機制發(fā)揮其作用的?對這些問題的回答無疑將有助于我們更好的理解血管內皮細胞對于腫瘤細胞的作用，為進一步以血管內皮細胞為靶點的腫瘤治療提供新的策略。
　　 基于此，本課題的研究分為二部分完成：
　　 一.人胚胎干細胞定向誘導生成內皮祖細胞<

5、br>　　 保持良好干性的hESCs經膠原酶消化后，與MEF共培養(yǎng)，利用4步程序性誘導方法使其向內皮祖細胞分化：含有BMP4（10ng/ml）的培養(yǎng)基培養(yǎng)4天→去除BMP4后培養(yǎng)6天→使用MiniMACS系統(tǒng)分選CD34+細胞→使用EGM-2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7-10天。對誘導分化后的細胞進行形態(tài)學、特異基因表達及功能等方面的系列檢測，與此同時，對誘導分化后的細胞在EGM-2培養(yǎng)體系中繼續(xù)擴增培養(yǎng)。
　　 結果表明：誘導后的細胞呈

6、梭形，形態(tài)均一，生長穩(wěn)定，原代及傳代后的細胞RT-PCR法均能檢測到內皮細胞相關基因CD31、CD34、VE-cad、KDR、vWF、eNOS及平滑肌相關基因α-SMA；免疫熒光染色表達CD31、VE-cad和VEGF；能夠吞噬低密度脂蛋白，并在Matrigel基質膠上形成管腔樣結構；更換為平滑肌細胞培養(yǎng)基后，細胞增寬，體積增大，α-SMA基因表達增強22倍，免疫熒光染色可檢測到α-SMA蛋白。不同代數細胞基因表達差異不明顯。說明hES

7、Cs可以有效的誘導為EPCs，EPCs具有內皮細胞和平滑肌細胞雙向分化能力。
　　 二.內皮細胞促進腫瘤生長的作用研究及機制初探
　　 在本部分實驗中，我們首先分離、培養(yǎng)并鑒定人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），進而明確內皮細胞與腫瘤細胞的相互作用，利用裸鼠成瘤性實驗明確內皮細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學作用。與此同時，在以上實驗基礎上我們利用SiRNA干涉內皮細胞的HIF-1α的表達，初步探討HIF-1α在內皮細胞的生物學

8、功能發(fā)揮中所扮演的角色。
　　 結果表明：內皮細胞促進腫瘤細胞的遷移，侵襲能力，促進移植瘤的生長，參與并促進腫瘤血管形成；腫瘤細胞上調內皮細胞HIF-1α的表達。SiRNA干涉內皮細胞HIF-1α的表達后，體外對腫瘤細胞的遷移、侵襲能力的促進明顯下降，體內移植瘤生長速度及腫瘤血管密度與單獨移植腫瘤組無明顯差異，但較正常內皮細胞組明顯下降。說明HIF-1α在內皮細胞促進腫瘤血管形成過程中發(fā)揮了關鍵性的作用。
　　 本課題通