綠豆NBS-LRR類抗病基因克隆及其表達(dá)研究.pdf_第1頁(yè)
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1、綠豆是重要的農(nóng)作物之一,綠豆中的某些成分有直接抑菌作用,抗病性極強(qiáng)。大豆不僅是人們的食用糧食,而且是飼料的重要來(lái)源,但是每年大豆產(chǎn)量因病害而大量減少,若是能從綠豆中克隆出抗病基因,再轉(zhuǎn)化大豆等農(nóng)作物,增強(qiáng)大豆等經(jīng)濟(jì)作物的抗病性,將減少農(nóng)藥使用帶來(lái)的環(huán)境污染等副作用。通過(guò)植物抗病基因的克隆并且轉(zhuǎn)化大豆等農(nóng)作物的研究,對(duì)于抗病育種和抗病機(jī)理的理解具有重要意義。
  目前,已有不少植物抗病基因及抗病基因同源序列被分離出來(lái),這些抗病基因都

2、各具特點(diǎn),大多數(shù)具有NBS結(jié)構(gòu)域,但是還沒(méi)有綠豆NBS抗病基因被克隆出來(lái),雖然目前從各種植物中克隆了很多NBS類抗病基因及抗病基因同源序列,但基本沒(méi)有將其轉(zhuǎn)化,并對(duì)其具體功能進(jìn)行驗(yàn)證。
  本研究通過(guò)克隆綠豆NBS-LRR類抗病基因同源序列,將其轉(zhuǎn)化煙草及大豆,初步研究了序列在煙草及大豆中的轉(zhuǎn)化情況,并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的抗病性做了初步檢測(cè)。本論文主要方法和結(jié)果如下:
  1、根據(jù)已克隆植物NBS-LRR抗病類基因(RGAs)保守

3、序列設(shè)計(jì)引物,從野生綠豆基因組DNA中分離得到了3條同源序列片段FGV-1,F(xiàn)JV-2,F(xiàn)JV-3(GenBank登錄號(hào)分別為KF021265、KF661550、KF661551)。經(jīng)BLAST分析表明,F(xiàn)GV-1,F(xiàn)JV-2,F(xiàn)JV-3與已報(bào)道的大豆、蕓豆、鷹嘴豆等植物的RGAs有較高的同源性。經(jīng)過(guò)Blastp分析表明,F(xiàn)GV-1、FJV-2、FJV-3基因翻譯的氨基酸序列中含有植物抗病保守結(jié)構(gòu)域NB-ARC,具有抗病基因NBS特征結(jié)

4、構(gòu)域:p-loop環(huán)、激酶2α、激酶3α及HD,推測(cè)序列FGV-1、FJV-2、FJV-3可能是綠豆NBS類抗性基因的核心區(qū)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,3條綠豆RGA序列可分為兩個(gè)不同的類群:TIR-NBS和non-TIR-NBS。
  2、利用pFGC5941構(gòu)建植物表達(dá)載體pFGC5941-FGV-1,通過(guò)酶切驗(yàn)證、PCR檢測(cè)及測(cè)序表明載體構(gòu)建成功。
  3、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將序列轉(zhuǎn)化煙草及大豆,PCR鑒定結(jié)果顯示,獲得pFG

5、C5941-FGV-1轉(zhuǎn)基因大豆植株27株,煙草20株,獲得轉(zhuǎn)基因大豆植株后代種子24顆,經(jīng)抗除草劑檢測(cè)結(jié)果表明,序列已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入大豆及煙草。
  4、提取轉(zhuǎn)基因大豆葉片RNA,利用RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,外源FGV-1基因已經(jīng)在大豆葉片中表達(dá)。
  5、用煙草花葉病毒侵染轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因煙草葉片,幾天后,非轉(zhuǎn)基因煙草葉片表現(xiàn)出花葉病病癥,而轉(zhuǎn)基因煙草葉片無(wú)明顯變化。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因煙草葉片表現(xiàn)出一定的抗病性。
  

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