1、研究背景和目的:
　　 調節(jié)性T細胞(regulatory Tcells，Treg)作為一類具有免疫調節(jié)功能的成熟T細胞亞群，在機體免疫反應過程中可通過對細胞免疫抑制發(fā)揮關鍵調控作用。與其他免疫細胞相比，CD4+CD25+Treg具有獨特的免疫特征，主要介導免疫抑制反應，通過T細胞受體信號刺激活化后引起輔助性T細胞(Th)1/Th2的漂移，進而影響炎癥結局。業(yè)已明確，一些可溶性分子和膜結合分子對Treg功能活性的發(fā)揮具有重要作用

2、，包括白介素(IL)-2、IL-10、轉化生長因子(TGF)-β、T淋巴細胞毒性相關抗原(CTLA)-4及糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(GITR)等。同時，叉頭翼狀螺旋轉錄因子(Foxp3)mRNA及編碼蛋白質特異性表達于CD4+CD25+Treg，直接影響Treg的表型及活性，可作為鑒定CD4+CD25+Treg最可靠的標志。與Foxp3相似，另一轉錄因子——活化T細胞核因子(NF-AT)也參與CD4+CD25+Treg的免疫調節(jié)

3、過程，并在Treg的發(fā)育及功能活性的發(fā)揮中起著重要作用。
　　 腫瘤壞死因子-α誘導蛋白-8樣分子2(tumornecrosisfactor-αinducedprotein8like-2，TIPE2)作為一種新發(fā)現的蛋白分子，與腫瘤壞死因子-α誘導蛋白-8家族成員擁有共有序列，被視為此家族成員之一。TIPE2選擇性表達于淋巴源性和髓源性細胞，主要表現為對固有免疫及細胞免疫的負向調節(jié)作用，抑制激活蛋白(AP)-1和核因子(NF)-

4、κB的活化，且TIPE2基因缺陷細胞呈現出對Toll樣受體(Toll-likereceptor,TLR)和T細胞受體信號活化的高反應性。在小劑量脂多糖(LPS)誘導膿毒癥小鼠模型中，TIPE2基因敲除組出現明顯膿毒性休克反應，并且TIPE2基因表達下調引起持續(xù)性淋巴細胞活化，Fas表達增強，促進淋巴細胞凋亡，并引起IL-4、IL-6、IL-12和干擾素(IFN)-γ等細胞因子的生成增多，但TIPE2表達是否影響Treg的免疫功能迄今尚不

5、清楚。
　　 本實驗采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)及Westernblot等技術初步檢測TIPE2在CD4+CD25+Treg中的表達情況。通過小片段干擾RNA（siRNA）技術沉默Treg細胞中TIPE2表達，觀察其對Foxp3、CTLA-4、IL-2、IL-10、TGF-β等免疫相關分子的影響。此外，將CD4+CD25+Treg與CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)，進一步分析Treg細胞中TIPE2表達改變對CD4+CD

6、25-T細胞抑制效應的影響，并通過檢測Th1（IFN-γ）及Th2(IL-4)型細胞因子了解T細胞功能極化的變化。該實驗旨在明確TIPE2對Treg介導T淋巴細胞免疫抑制功能的影響，為尋求嚴重感染并發(fā)癥的防治途徑提供新思路。
　　 方法:
　　 1.采用免疫磁珠法分離正常BALB/C小鼠脾臟CD4+CD25+Treg及CD4+T細胞，流式細胞術鑒定CD4+CD25+Treg細胞純度。
　　 2.設正常CD4+CD

7、25+Treg細胞組及陽性對照組CD4+T細胞，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察Treg細胞內TIPE2蛋白表達情況并進行初步定位;取分離出的Treg細胞與CD4+T細胞，同時按照總蛋白提取試劑盒從兩組細胞中提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，設陽性、陰性對照組分別為CD4+T細胞和肝臟組織。Westernblot法進一步檢測Treg細胞中TIPE2蛋白表達水平。此外，采用Trizol法提取小鼠CD4+CD25+Treg和CD4+T細胞（作為

8、陽性對照）總RNA，進行RT-PCR分析，在不加反轉錄酶的情況下(RT-)，用Treg細胞總RNA進行逆轉錄、擴增，CD4+T細胞TIPE2mRNA作為陽性對照，β-actin作為內參照。從基因水平檢測檢測Treg細胞中TIPE2mRNA表達情況。
　　 3.通過siRNA技術沉默Treg細胞TIPE2基因表達。分別設siRNA-TIPE2轉染后Treg細胞組、正常Treg細胞組、siRNA-TIPE2轉染后Treg細胞組;采用

9、流式細胞術分析CD4+CD25+Treg細胞表面標記物CTLA-4和轉錄因子Foxp3的表達變化，24小時(h)后收集各組細胞上清液，應用ELISA分析Treg分泌IL-10和TGF-β的變化。
　　 4.部分細胞用于siRNA-TIPE2轉染后，CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)（按1:1比例），另設空白對照組（CD4+CD25-T細胞）。調整細胞濃度接種于96孔板培養(yǎng)中，包被抗CD3和抗CD28激活細

10、胞，MTT法檢測CD4+CD25+Treg對CD4+CD25-T細胞的抑制效應。
　　 5.設siRNA-TIPE2轉染后Treg細胞組、正常Treg細胞組、無意義序列轉染Treg細胞組，按1:1比例分別與分離的CD4+CD25-T細胞混合，同時另設空白對照組(CD4+CD25-T細胞)。68h收集各組細胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測上清液中IL-2、IFN-γ/IL-4水平的變化;部分細胞分組檢測核內NF-AT活性變化，分別設CD

11、4+CD25-T對照組、Treg/CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)組、siRNA-TIPE2轉染Treg/CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)組;scramble轉染Treg/CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)組，68h后收集各組細胞ELISA檢測核內NF-AT活性。
　　 6.統計學方法
　　 采用SPSS13.0統計軟件對數據進行分析，計量資料用(x)±s表示，單因素多組數據進行方差分析(One-WayANOVA)，倆樣本間比較

12、采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。
　　 主要結果和結論:
　　 1.正常小鼠脾臟單核細胞經過MACS兩次分選后，通過流式細胞儀檢測得到CD4+CD25+Treg純度可達92％。CD4+CD25+Treg經過臺盼藍染后檢測，其活性大于98％。
　　 2.異硫氰酸熒光素(FITC)間接熒光標記TIPE2，激光共聚焦顯微鏡成像分析顯示CD4+CD25+Treg細胞中表達TIPE2;Westernblot檢

13、測證實CD4+CD25+Treg細胞檢測到清楚的TIPE2條帶，分子量約為21kD;RT-PCR分析發(fā)現，CD4+CD25+Treg細胞中檢測到147bp大小的特異性TIPE2目的基因條帶。
　　 3.抗CD3/CD28聯合刺激CD4+CD25+Treg與siRNA-TIPE2轉染CD4+CD25+Treg組24h后，CTLA-4平均熒光強度在TIPE2沉默CD4+CD25+Treg細胞組顯著下降(t=13.596，P=0.00

14、0)。此外，Foxp3被視為CD4+CD25+Treg細胞的特異性標志，Foxp3基因突變可直接導致CD4+CD25+Treg功能缺陷及出現致命性自身免疫狀態(tài)。本實驗中流式細胞分析結果顯示，Foxp3平均熒光強度在siRNA-TIPE2轉染CD4+CD25+Treg組出現顯著下降(t=28.833，P=0.000)。由此可見，沉默CD4+CD25+Treg細胞TIPE2表達后CTLA-4和Foxp3均呈現表達下調的變化趨勢，初步說明Tr

15、eg細胞中TIPE2水平影響其標記物CTLA-4和Foxp3的表達，且兩者的變化呈平行關系。
　　 4.ELISA結果顯示:抗CD3/CD28聯合刺激CD4+CD25+Treg與siRNA-TIPE2轉染CD4+CD25+Treg組24h后，轉染組細胞上清液中檢測到較低水平IL-10、TGF-β，與正常CD4+CD25+Treg細胞比較均有統計學差異(t=8.054，P=0.000;t=6.454，P=0.000)。許多研究證實

16、，在Treg細胞介導的免疫耐受過程中，免疫抑制因子IL-10和TGF-β發(fā)揮關鍵作用。本實驗中，沉默CD4+CD25+Treg細胞TIPE2基因表達后，聯合抗CD3/CD28刺激條件下觀察CD4+CD25+Treg細胞分泌IL-10和TGF-β的變化情況。結果顯示，TIPE2基因沉默后細胞上清液中IL-10和TGF-β水平與正常組細胞相比均出現顯著下調，表明CD4+CD25+Treg細胞TIPE2表達可能影響其抑制性細胞因子的生成。

17、r>　　 5.CD4+CD25-T細胞為主要的效應性T細胞，其增殖活性對于維持正常的免疫應答起著重要作用。本組資料中，通過T細胞增殖試驗進一步觀察了TIPE2對CD4+CD25+Treg抑制功能的影響。采用MTT檢測結果發(fā)現，在抗CD3/CD28聯合刺激下，與效應性T細胞單獨培養(yǎng)組相比，加入CD4+CD25+Treg細胞后T細胞增殖活性顯著下降(P=0.000)。通過siRNA沉默CD4+CD25+Treg細胞TIPE2蛋白表達，si

18、RNA-TIPE2轉染CD4+CD25+Treg組T細胞增殖活性反而增強(P=0.000)。在CD4+CD25+Treg與CD4+CD25-T共培養(yǎng)后，T細胞增殖能力明顯受到抑制，提示TIPE2基因沉默后CD4+CD25+Treg的免疫抑制功能有所減弱。
　　 6.無意義序列scramble轉染CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)組與正常Treg組比較，反映T淋巴細胞增殖活性的OD540值沒有統計學差異(P

19、＞0.05);siRNA-TIPE2轉染CD4+CD25+Treg后與CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)，68h檢測共培養(yǎng)上清中IL-2的濃度變化。結果顯示，CD4+CD25-T細胞分泌一定量的IL-2，加入CD4+CD25+Treg細胞后其水平明顯下降(P=0.000)，但siRNA-TIPE2轉染CD4+CD25+Treg細胞組IL-2水平顯著升高(P=0.000)。陰性對照組（scramble轉染CD4+CD25+Treg細胞組）與C

20、D4+CD25+Treg細胞組相近(P＞0.05)。有資料證實，IL-2與T淋巴細胞增殖密切相關，T淋巴細胞通過自分泌、旁分泌或內分泌的形式產生IL-2，作用于自身或其他T淋巴細胞。Treg細胞除介導免疫抑制功能外，還具有免疫無能性，主要表現為對高濃度IL-2的單獨刺激、固相包被或可溶性抗CD3單抗及抗CD3單抗/抗CD28單抗的聯合作用呈無反應狀態(tài)，也不分泌IL-2。共培養(yǎng)上清中IL-2由效應T細胞分泌，本實驗中下調CD4+CD25+

21、Treg細胞TIPE2表達后，CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)上清液IL-2水平較正常對照組明顯升高，TIPE2表達可能與CD4+CD25+Treg細胞抑制效應T細胞分泌IL-2或加速IL-2的消耗有關，進而抑制T淋巴細胞的增殖。
　　 7.實驗中siRNA-TIPE2轉染CD4+CD25+Treg細胞后，極化Th2細胞能力減弱，IFN-γ/IL-4濃度比值上升，向Th1細胞方向極化(P=0.000)。

22、培養(yǎng)上清中IFN-γ/IL-4比值較正常對照組有統計學差異。Treg介導的免疫抑制效應是經T細胞受體信號刺激活化后引起Th1/Th2的漂移，即IFN-γ/IL-4比值降低，極化Th2細胞。但本實驗中，下調CD4+CD25+Treg細胞TIPE2表達顯著增加了IFN-γ/IL-4比值，TIPE2可能參與了CD4+CD25+Treg介導的Th2極化過程。
　　 8.在CD4+CD25-T細胞中加入CD4+CD25+Treg后，轉錄因

23、子NF-AT活性顯著下降(P=0.000);siRNA-TIPE2轉染CD4+CD25+Treg組NF-AT活性則明顯上調(P=0.000)，說明TIPE2影響CD4+CD25-T細胞中轉錄因子NF-AT活化。一般認為，轉錄因子NF-AT家族被視為重要的調節(jié)因子之一，在調節(jié)細胞因子IL-2的轉錄及協調其他細胞因子表達中起核心作用。既往研究中我們發(fā)現在抗CD3單抗、抗CD28單抗的聯合刺激下，CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-