1、天牛是鞘翅目昆蟲中較大的一個類群，在世界各地廣有分布，其幼蟲大多以木質纖維為食，林木、果樹、桑、茶、棉、木建材料、家具等都可以受到天牛的危害，林木的天牛受害率達20-90％，每年造成的經(jīng)濟損失上億元。由于天牛幼蟲營鉆蛀性生活，生活隱蔽，活動期長，所以防治工作難度很大。目前的主要防治方法仍是以傳統(tǒng)的人工鉤殺幼蟲、砸卵、堵洞和化學藥劑防治等方法為主。其中人工防治費時、費工、成本又高，不適用于規(guī)?；筠r(nóng)場生產(chǎn)；利用化學防治藥劑防治由于藥劑有效

2、期短，不易達到蟲體，而且容易導致害蟲抗藥性增強以及具有污染環(huán)境、殺傷天敵的弊端。因此，探索新的防治途徑，開發(fā)新的防治技術，已成為生產(chǎn)上的迫切要求。新的害蟲防治方法和理論完善與發(fā)展離不開昆蟲生理生化的研究。近年來，研究昆蟲腸道正常菌群和腸道微生態(tài)以探索新的害蟲控制方法正在成為國內外研究的熱點之一。
　　本文用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和現(xiàn)代分子生物學方法－16S rDNA分析法對桑粒肩天牛幼蟲腸道微生物組成進行了研究，在此基礎上，首次探索將殺蟲基

3、因轉入天牛幼蟲腸道常駐的和優(yōu)勢的正常菌群載體菌，以構建在昆蟲腸道中高定植率、高生存力、高繁殖并能表達殺蟲毒蛋白伴孢晶體的新型殺蟲工程菌。研究將可能為害蟲的生物防治開辟一條新的途徑，為新型轉基因生物農(nóng)藥的研發(fā)提供理論依據(jù)與技術支撐。
　　主要研究結果如下：
　?、儆脗鹘y(tǒng)的培養(yǎng)方法從桑粒肩天牛幼蟲腸道中共分離鑒定出18個種的細菌，它們分別是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsilla Oxytoca)、成團桿菌(Enterobacter

4、cloacae)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、弗氏志賀氏菌(Shiqella flexneri)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、鮑氏志賀氏菌(Shiqella boydii)、人葡萄球菌(Staphylococcus homis)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、Breneria que

5、rcina、無花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、Naxibacter haematophilus、產(chǎn)氣長桿菌(Enterobacter aerogens)、克里斯汀微球菌(Micrococcus kristinae)、阿氏腸桿菌(Enterobacte

6、r absburiae)。其中溶血葡萄球菌(S. haemolyticus)、人葡萄球菌(S. homis)、短短芽孢桿菌(B. brevis)、蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis)等在幼蟲腸道中全年均能分離到，成團桿菌(E. cloacae)、產(chǎn)氣腸桿菌(E. aerogens)、阿氏腸桿菌(E. absburiae)可在1～2月份外的全年的大部分時間分離到，其它細菌種類則只能在4～11月份分離到，說明至少溶血葡萄球菌(

7、S. haemolyticus)、人葡萄球菌(S. homis)、短短芽孢桿菌(B. brevis)、蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis)應為天牛腸道常駐菌群，而其余種類微生物則很可能是隨進食或與環(huán)境接觸而進入的過路菌群。根據(jù)分離率和腸道菌群培養(yǎng)的數(shù)量統(tǒng)計結果表明天牛腸道優(yōu)勢菌群是葡萄球菌屬(Staphylococcus)細菌中的溶血葡萄球菌(S. haemolyticus)和人葡萄球菌(S. homis)，其菌量分別為7

8、.74±0.61和7.66±0.25，分離率分別為100%和98.09%。
　?、趯磦鹘y(tǒng)方法從桑粒肩天牛幼蟲腸道分離、鑒定的18個不同種的細菌作為PCR模板，進行16S rDNA序列的分析，經(jīng)與數(shù)據(jù)庫中登錄序列比對，鑒定結果與分離培養(yǎng)方法所獲得的結果一致。所測序列與Genbank中同種細菌的16S rDNA序列相似性分別為98.58％、99.18％、97.86％、99.89％、98.02%、99.19%、99.32%、98.46

9、%、99.30%、98.05％、96.97％、98.33％、99.46％、99.60%、99.03%、99.45%、99.01%、99.52%，均高于98％，說明鑒定結果正確。所得菌株的16S rRNA都已在Genbank中登錄注冊，系統(tǒng)接受號為EU554427-EU554444。
　?、蹖⒑屑t霉素抗性基因和cry3A基因的Escherichia coli-Bacillus thuringiensis穿梭表達質粒pHT305a和

10、pHT7911轉入桑粒肩天牛幼蟲腸道優(yōu)勢常駐菌溶血葡萄球菌(S. haemolyticus)、人葡萄球菌(S. homis)和常駐內生菌短短芽孢桿菌(B. brevis)、蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis)中，獲得的轉化子中外源基因能穩(wěn)定自主復制，而且其中用紅霉素抗性平板篩選出的常駐內生工程菌轉化子在產(chǎn)伴孢晶體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至90%以上芽孢脫落晶體釋放時的菌液可提取到經(jīng)SDS-PAGE分析分子量為65KDa的伴孢晶體蛋