1、鈣離子/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱ(Calcium/calmodulin-dependent proteinkinaseⅡ，CaMKII)在學(xué)習(xí)記憶與突觸可塑性中發(fā)揮了重要作用，α和βCaMKII是前腦中存在的主要亞型。αCaMKII亞型在突觸可塑性中的作用已被廣泛研究，而對(duì)于βCaMKII亞型在突觸可塑性中的作用卻知之甚少?，F(xiàn)采用海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)區(qū)域特異性過量表達(dá)βCaMKII的蛋白修飾轉(zhuǎn)基因小鼠，通過離體電

2、生理學(xué)和整體行為學(xué)技術(shù)，研究了βCaMKII高表達(dá)對(duì)該腦區(qū)突觸可塑性以及海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶的影響。本課題研究主要包括以下四部分：
　　 1.轉(zhuǎn)基因小鼠βCaMKII蛋白表達(dá)的檢測Western bloting的結(jié)果顯示，βCaMKII在轉(zhuǎn)基因小鼠海馬突觸小體的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，這為我們的后續(xù)工作的開展奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.βCaMKII-F90G轉(zhuǎn)基因小鼠DG區(qū)基本突觸傳遞及齒狀回顆粒細(xì)胞的基本電生理特性分析內(nèi)嗅皮

3、層可以通過內(nèi)側(cè)穿通通路(Medial Perforant Pathway，MPP)和外側(cè)穿通通路(Lateral Perforant Pathway，LPP)投射到達(dá)齒狀回。MPP和LPP的雙脈沖反應(yīng)分別表現(xiàn)為雙脈沖抑制(Paired-Pulse Depression，PPD)和雙脈沖易化(Paired-Pulses Facilitation，PPF)。現(xiàn)采用離體腦片場電位技術(shù)，分別比較βCaMKII-F90G轉(zhuǎn)基因小鼠與同窩對(duì)照小鼠D

4、G區(qū)兩條通路的雙脈沖反應(yīng)。結(jié)果顯示：與野生型同窩對(duì)照鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠的MPP通路的PPD現(xiàn)象和LPP通路的PPF現(xiàn)象均沒有發(fā)生顯著的變化，表明βCaMKII在海馬齒狀回區(qū)域的過量表達(dá)不影響轉(zhuǎn)基因小鼠MPP和LPP通路突觸前遞質(zhì)釋放功能。
　　 采用離體腦片膜片鉗技術(shù)，分別測定了βCaMKII-F90G轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞(granule cell)的靜息膜電位(Resting MembranePotenti

5、al，Vm)和電流電壓曲線(Voltage-Current Plot)。結(jié)果顯示均無顯著性差異，提示：βCaMKII過量表達(dá)沒有改變海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的基本電生理特性。
　　 3.不同頻率的刺激對(duì)βCaMKII-F90G轉(zhuǎn)基因小鼠DG區(qū)內(nèi)側(cè)和外側(cè)穿通通路長時(shí)程突觸可塑性分析LTD作為長時(shí)程突觸可塑性的主要形式之一，被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的可能細(xì)胞突觸機(jī)制。采用離體腦片場電位記錄技術(shù)，研究了βCaMKII在DG特異性過量表達(dá)對(duì)MPP通

6、路LTD的影響。我們分別采用1Hz，15min和3Hz，5min的低頻誘導(dǎo)方法。結(jié)果顯示，與同窩對(duì)照小鼠相比，低頻刺激(1Hz，15min和3Hz，5min)在βCaMKII-F90G轉(zhuǎn)基因小鼠上都不能誘導(dǎo)出顯著的LTD現(xiàn)象，并且兩組之間有顯著差異。而在相同的刺激條件下，在人工腦脊液中加入βCaMKII-F90G特異性拮抗劑NM-PP1(0.5μM)能補(bǔ)償βCaMKII-F90G轉(zhuǎn)基因鼠海馬齒狀回LTD缺陷。結(jié)果表明過表達(dá)的βCaMKI

7、I亞型會(huì)減弱海馬DG區(qū)的LTD。
　　 使用5Hz，3min和10Hz，1.5min刺激后，發(fā)現(xiàn)βCaMKII-F90G轉(zhuǎn)基因小鼠海馬齒狀回的突觸反應(yīng)與基線反應(yīng)相比有所減小，而對(duì)照組的卻有所增大，兩組之間有顯著性差異。頻率反應(yīng)曲線顯示在3Hz和5Hz之間，兩組突觸反應(yīng)關(guān)系發(fā)生逆轉(zhuǎn)，并且βCaMKII-F90G小鼠的突觸可塑性頻率反應(yīng)曲線較野生組平緩。以上結(jié)果表明，βCaMKII在海馬齒狀回特異性過量表達(dá)使小鼠MPP通路的突觸可塑

8、性受損。
　　 此外，我們還采用1Hz，15min的低頻誘導(dǎo)方法在LPP通路上得到與MPP通路相似的結(jié)果。這也符合LPP通路與MPP通路有類似的突觸可塑性現(xiàn)象，使得“βCaMKII過量表達(dá)會(huì)減弱海馬DG區(qū)的LTD現(xiàn)象”這一結(jié)論再次獲得驗(yàn)證。
　　 4.βCaMKII-F90G轉(zhuǎn)基因小鼠基本行為和海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶的行為學(xué)分析在進(jìn)行學(xué)習(xí)與記憶相關(guān)行為學(xué)檢測前，我們利用開場實(shí)驗(yàn)(open field)和明暗箱(light-d

9、ark transition test)等行為學(xué)方法，對(duì)βCaMKII-F90G轉(zhuǎn)基因小鼠的行為及情緒表現(xiàn)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠與野生對(duì)照組鼠的活動(dòng)量和探索性無顯著差異，從而可以排除這些因素影響其學(xué)習(xí)與記憶能力的可能。
　　 為了探明小鼠海馬齒狀回過量表達(dá)βCaMKII對(duì)海馬相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶功能的影響，我們利用被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)(passive avoidance test)，發(fā)現(xiàn)βCaMKII-F90G轉(zhuǎn)基因模式小鼠海馬依賴

10、的記憶和消退能力與野生對(duì)照組相比均明顯受損。由此推測βCaMKII在海馬齒狀回過量表達(dá)可能會(huì)損害小鼠的靈活性學(xué)習(xí)能力。
　　 本研究結(jié)果提示，βCaMKII的過量表達(dá)不影響小鼠海馬齒狀回區(qū)的突觸前遞質(zhì)釋放功能和顆粒細(xì)胞的基本電生理特性，但βCaMKII參與了海馬齒狀回LTD的形成，并且βCaMKII過量表達(dá)對(duì)小鼠齒狀回穿通通路的突觸可塑性頻率反應(yīng)曲線產(chǎn)生顯著影響。此外行為學(xué)結(jié)果提示，βCaMKII-F90G轉(zhuǎn)基因小鼠海馬依賴的學(xué)