1、蘋果(Malus×domestica Brokh.)是童期長、基因組高度雜合且自交不親和的果樹樹種，通過常規(guī)育種手段較難獲得純合基因型種質。當前蘋果主栽品種屬于雜交嫁接品種，蘊含了豐富的優(yōu)良性狀遺傳資源，挖掘新的優(yōu)良純合基因型種質親本是加速蘋果育種進程的重要步驟?；ㄋ庪x體培養(yǎng)作為單倍體育種的主要手段，可在短期內直接誘導胚狀體形成途徑快速獲得純合基因型新種質。這些新種質很大程度豐富了蘋果育種親本種質資源，為挖掘蘋果優(yōu)良性狀基因提供了重要材

2、料，為后期的田間性狀篩選，雜交育種奠定了堅實基礎。
　　本研究以早熟多抗品種嘎拉(Gala)、富士(Fuji)和丹霞(Danxia)為試驗品種，并采集蘋果單核靠邊期到雙核早期花藥（未開放的花蕾）為實驗材料。首先研究了低溫處理花藥對糖轉運蛋白基因SWEET表達的影響。經在4℃低溫處理10天和30天后，采用定量PCR對MdSWEET1基因表達量進行檢測。其次對蘋果花藥經低溫預處理30天后進行離體培養(yǎng)，并選用蘋果SSR標記對再生植株進行

3、基因型鑒定。最后對再生植株進行植物學觀察。結果如下:
　　1.蘋果中MdSWEET1基因編碼一個含有3個α-螺旋的跨膜結構蛋白，N端位于膜外。隨低溫預處理時間增加MdSWEET1基因表達顯著下調，下調的MdSWEET1基因表達可能影響花粉的發(fā)育分化而轉向與胚狀體誘導，有利于再生植株的發(fā)生。
　　2.蘋果花藥經低溫預處理30天后進行離體培養(yǎng)，共接種“嘎啦”花藥74200個，從未被污染的5萬多個花藥中成功誘導形成386個胚狀體（

4、胚狀體誘導率0.7％），經分化培養(yǎng)獲得64株再生苗（植株再生率16.6％）。經過繼代培養(yǎng)，最終獲得30個成活再生株系。FACS流式細胞儀倍性分析，其中包括28個二倍體株系，1個單倍體株系和1個四倍體株系。同樣的培養(yǎng)體系，獲得9個“丹霞”再生株系，7個“富士”再生株系。
　　3.選用130個蘋果HIDRAS數(shù)據(jù)庫SSR標記對所有植株進行PCR擴增，經過凝膠電泳(PAGE)檢測PCR擴增產物，PAGE結果表明:篩選到20個SSR標記（

5、其余標記不具有多態(tài)性或帶型雜亂）可鑒定“嘎啦”再生株系均為花粉（小孢子）單倍體細胞來源;“丹霞”和“富士”分別篩得16個SSR標記、17個SSR標記以鑒定再生株系來源于單倍體細胞。
　　4.蘋果有17個連鎖群，每一個連鎖群對應一個SSR標記，進一步從20個SSR中篩選出17個SSR標記，采用毛細管電泳進行基因型鑒定對所獲得的30個“嘎啦”再生株系。結果表明這組SSR標記能有效區(qū)分鑒定不同再生植株基因型。
　　5.繼代培養(yǎng)60

6、d后的嘎啦再生植株的形態(tài)學觀察顯示:不同再生株系的株高、葉長、葉寬等特征差異明顯。不同二倍體純合植株的植物學特征也存在差異:Gala05植株相對較高，葉基變寬，葉尖漸尖;Gala07葉片變小、變厚，葉柄變短且基部寬大，葉色深且有很強的光澤度;Gala18葉片較小，葉數(shù)較多。純合二倍體再生植株長勢弱于Gala雜合供體，但強于單倍體和純合四倍體的趨勢。
　　本研究結果證明，單倍體花藥離體培養(yǎng)是創(chuàng)制蘋果新種質的有效手段。獲得的純合體材料