1、本實驗以hTERT為作用靶點，運用RNAi技術，將能表達hTERT-siRNA的質(zhì)粒載體轉染K562細胞，旨在探索有效降解hTERTmRNA、抑制端粒酶活性的siRNA序列，觀察質(zhì)粒載體誘導RNAi維持目的基因沉默的持續(xù)時間，為RNAi技術在端粒酶抑制劑和腫瘤治療方面的應用進行實驗研究。 研究方法： (1)根據(jù)端粒酶hTERT基因序列依據(jù)siRNA設計原則，設計合成三條21bp的siRNA鏈，轉染K562細胞觀察hTER

2、T抑制效應，根據(jù)結果選取兩條能高效特異抑制目的基因hTERTmRNA表達的siRNA鏈，然后分別設計合成2對65nt的寡核苷酸(shDNA)用以構建表達載體，shDNA基本結構為：BamHISense+Loop+Antisense+終止信號(TTTTTT)+SalⅠ+HindⅡ，將互補的兩條單鏈寡核苷酸退火連接到質(zhì)粒載體中，經(jīng)酶切結果鑒定是否成功構建。 (2)以人紅白血病細胞株k562為實驗對象，實驗分五組：空白對照組、pGC-

3、hTERT-1、pGC-hTERT-2、陰性對照組、陽性對照組(pGC-GAPDH)。 (3)選取生長健康處于分裂增殖期的細胞，調(diào)整細胞密度為(0.5-1)×106/ml，以陽離子脂質(zhì)體為轉染試劑，對各組質(zhì)粒載體進行轉染，作用48h和72h后收集細胞，用熒光顯微鏡和流式細胞儀觀察各作用組細胞的轉染率，然后用含G418的培養(yǎng)液對各作用組的細胞進行篩選，直至空白對照組的細胞全部殺死，收集其它作用組細胞進行結果測定。 (4)分

4、別用RT-PCR檢測靶基因hTERTmRNA和GAPDH基因的表達情況、PCR-ELISA法檢測細胞的端粒酶活性，流式細胞儀檢測各作用組細胞凋亡率。 研究結果： (1)三條化學合成的siRNA鏈中，有兩條siRNA-1和siRNA-2在48h能明顯抑制hTERTmRNA的表達，抑制率分別為85﹪和45﹪，故選此二鏈構建siRNA表達載體。 (2)質(zhì)粒載體插入目的基因片段之后，PstⅠ酶切位點被取代，故不能被Pst

5、Ⅰ所酶切，插入的目的基因片段里設計了一個SalⅠ的酶切位點，故能被SalⅠ酶切出一條約400bp的DNA片斷，凝膠電泳圖譜均顯示有一條約400bp的DNA片斷，故質(zhì)粒載體構建成功。 (3)細胞轉染48h后熒光顯微鏡顯示各作用組細胞中均有綠色熒光蛋白，質(zhì)粒載體轉染成功，同時流式細胞儀檢測細胞轉染率為pGC-hTERT-1組5.74﹪，pGC-hTERT-2組5.66﹪，陰性對照組7.5﹪，pGC-GAPDH組4.31﹪。

6、(4)細胞在G418培養(yǎng)液中培養(yǎng)5天后，空白對照組的細胞全部死亡，收集篩選后的K562細胞進行結果檢測。 (5)RT-PCR結果顯示，陽性對照組(pGC-GAPDH)的GAPDHmRNA表達較1-4組明顯下調(diào)，與陰性對照組相比pGC-hTERT--1組pGC-hTERT-2組在48h和72hhTERTmRNA的表達都下調(diào)，且以pGC-hTERT-1組的作用更加明顯。 (6)端粒酶活性pGC-hTERT-1作用組48h(0

7、.552±0.031)72h(0.382±0.11)、pGC-hTERT-2作用組48h(0.61±0.042)72h(0.52±0.72)與陰性對照組(0.786±0.314)相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 (7)細胞凋亡率pGC-hTERT-1組48h(14.33±1.16﹪)pGC-hTERT-2組48h(10.41±1.26﹪)與陰性對照組(7.64±0.484﹪)相比有顯著性差異(P＜0.05)，72h細胞凋亡率漸

8、下降pGC-hTERT-1組(10.02±0.85﹪)pGC-hTERT-2組(6.77±1.24﹪)而陰性對照組(8.07±0.166﹪)較48h升高，二者比較無統(tǒng)計學差異。 研究結論： (1)化學合成的siRNA-1和siRNA-2鏈能以一定的序列特異性高效抑制hTERTmRNA表達，抑制率分別為85﹪和45﹪。 (2)在陽離子脂質(zhì)體作用下質(zhì)粒載體能成功轉染到K562細胞中，轉染率分別為5.74﹪、5.66﹪

9、、7.5﹪、4.31﹪。 (3)陽性對照組(pGC-GAPDH)能明顯抑制GAPDHmRNA的表達，表明該質(zhì)粒載體介導RNAi的有效性，靶向hTERT的質(zhì)粒載體能夠明顯下調(diào)K562細胞hTERTmRNA的表達，并表現(xiàn)出一定的序列特異性。 (4)該質(zhì)粒載體介導的RNAi能夠抑制K562細胞端粒酶活性，抑制時間能達到一周甚至更長。 (5)48h時各質(zhì)粒載體作用組較陰性對照組能明顯增加細胞凋亡率，但隨著時間的延長細胞凋