1、目的與意義:
　　BK病毒(BK virus,BKV)屬于多瘤病毒(polyomavirus)一種,是導致腎移植術后移植物腎病的重要危險因素。隨著腎移植手術的廣泛開展,由BKV感染導致移植物功能受損、進展為BK病毒性腎病(BKVN)進而導致移植物丟失的病例報道逐漸增多。根據國外研究顯示,在腎移植受者中有1％~5%的人會發(fā)生BKVN,其中大約50%導致移植腎失功,由此引起了移植學者的高度重視。當前對引起B(yǎng)KV感染或病毒激活的危險因素

2、尚不明確,而BKVN與強效免疫抑制劑的廣泛應用的時間幾乎同時出現(xiàn),意味著機體細胞免疫功能的改變扮演了重要角色,由此大多數學者認為移植受者機體免疫抑制狀態(tài)是引起B(yǎng)KV感染復發(fā)的最重要因素。然而,目前國外對腎移植受者BKV感染免疫狀態(tài)監(jiān)測的研究非常少見,國內則未發(fā)現(xiàn)有文獻報道針對該領域的探索。因此,本課題在我研究所前期對BKV感染流行病學研究的基礎上,進一步開展前瞻性隨機對照研究,通過監(jiān)測觀察移植受者的細胞和體液免疫狀態(tài),揭示BKV感染的免

3、疫機制,為BKV感染和發(fā)生BKVN的移植受者監(jiān)控以及治療方案的選擇提供免疫學理論依據。
　　方法:
　　1、研究對象選擇:選擇在解放軍第309醫(yī)院器官移植研究所進行同種異體腎移植術的受者作為研究對象,并選擇同時期健康人群做為陰性對照組。
　　2、標本的采集:入組的研究對象于術前及術后每三個月定期收集尿液和血液標本,進行real-time PCR BKV DNA載量監(jiān)測,對于符合標準的研究對象活檢穿刺,行病理學檢查。

4、r>　　3、研究對象分組:根據BKV感染篩查結果將研究對象分為四組,即正常受者、病毒尿癥受者、病毒血癥受者和病毒性腎病受者。
　　4、BKV感染監(jiān)測方法:檢測研究對象尿液和血液BKV DNA載體量:收集研究對象尿液及外周血標本,應用BKV試劑盒(我所專利技術,專利號:201110211891.1)通過real-time PCR技術檢測移植術后受者尿液及外周學標本BKV DNA載量。檢測陽性標準為大于或等于1×103copies/m

5、l。
　　5、BKV特異性免疫反應的檢測方法:細胞免疫反應檢測方法:提取并純化研究對象外周血單個核細胞(PBMC),流式細胞儀檢測研究對象CD3+、CD4+和CD8+T細胞亞群。制備包含BK病毒 VP1、VP2、VP3、LT-Ag和st-Ag肽段的重疊肽池(overlapping peptide pools),應用重疊肽池與PBMC混合培養(yǎng),體外刺激PBMC生成相應的細胞因子,應用流式細胞儀檢測體外培養(yǎng)后PBMC中CD3+、CD4

6、+和CD8+T細胞亞群,應用流式細胞學檢測INF-γ/IL-2/TNF-α誘導型BK病毒特異性T細胞增殖情況,分析BKV細胞免疫反應狀態(tài)。
　　6、其他相關臨床資料的收集:一般臨床資料(包括研究對象性別﹑年齡﹑供腎類型﹑配型情況、術后并發(fā)糖尿病(PTDM)﹑急性排斥反應和(AR)術后早期肺部感染(pneumonia)以及免疫誘導方案、單獨和聯(lián)合免疫抑制方案等相關資料);實驗室指標(重點記錄移植腎功能指標(血肌酐、尿素氮、尿酸)、免

7、疫抑制藥物濃度、血常規(guī)、尿常規(guī)等相關實驗室檢驗指標)7、統(tǒng)計學方法:應用Excel2007軟件進行實驗數據錄入及表格繪制。應用SPSS統(tǒng)計軟件(16.0版)統(tǒng)計學分析,符合正態(tài)分布的數據應用平均值±標準差表示,并應用隨機分組t檢驗、方差分析進行統(tǒng)計學分析,不符合正態(tài)分布的數據應用平均值,最小值和最大值表示,并應用秩和檢驗進行統(tǒng)計學分析。應用ROC曲線下面積對比分析BK病毒尿癥和BK病毒血癥預測BKVAN進展的價值,應用相關分析和logi

8、stic回歸分析BK病毒感染的危險因素。應用graphpad(5.0版)軟件進行繪圖制作。
　　結果:
　　1、尿液BKV DNA載量預測BKVN發(fā)生的陽性指標為5.04±0.15 log10copies/ml,血漿BKV DNA載量為4.08±0.10 log10copies/ml。尿BKV DNA載量指標預測BKVN發(fā)生的敏感度100%,特異度57.7%(P=0.003),其陽性預測值(PV+)為26.3%,陰性預測值(

9、PV-)為95.7%。應用血BKV DNA載量指標預測BKVN發(fā)生的敏感度100%,特異度82.9%(P=0.002),其陽性預測值(PV+)為83.3%,陰性預測值(PV-)為98.8%。
　　2、在對210例腎移植術后早期受者的臨床觀察中,尿BKV DNA陽性者92例(43.8%),尿BKV DNA載量中位數為4.32×105copies/ml(5.73×103~9.44×109 copies/ml);血BKV DNA陽性者4

10、6例(21.9%),血BKV DNA載量中位數為5.55×103 copies/ml(3.28×103~11.38×106 copies/ml],病理學活檢證實BKVN者7例(3.3%)。術后6~9個月是病毒尿癥和病毒血癥發(fā)生率最高的時間點。
　　3、服用FK506是術后發(fā)生病毒血癥的危險因素(r=0.232,P=0.012),服用CsA對發(fā)生病毒血癥的影響顯示了負相關關系(r=-0.232,P=0.012)。其余各種免疫誘導治療

11、方案(ATG/IL-2R/無誘導)與術后BKV感染的發(fā)生未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學相關性(P>0.05)。術前病毒血癥陽性與移植術后BKV感染有統(tǒng)計學相關性(P<0.05)。性別﹑供腎類型﹑術后糖尿病、急性排斥反應、術后早期肺部感染均與BKV感染無統(tǒng)計學相關性(P>0.05)。
　　4、腎移植術后病毒血癥受者的術后3個月內最低肌酐值為108.6±31.5μmol/L,發(fā)現(xiàn)BK病毒血癥時的血清肌酐值為187.5±85.6μmol/L,兩者比較有統(tǒng)

12、計學顯著差異(P<0.001)。而病毒尿癥受者在發(fā)生前后血肌酐比較未見統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　5、腎移植術后受者BKV特異性蛋白VP1、VP2、VP3、LT和st體外刺激細胞免疫反應以CD4+ T細胞占優(yōu)勢比例(>90%)。在發(fā)生病毒血癥和BKVN時VP1、VP2、VP3體外刺激IL-2/IFN-γ+/TNF-α+ CD4+T細胞免疫反應強度均明顯下降(P<0.05)。LT、st體外刺激細胞性免疫反應變化差異未見統(tǒng)計學差

13、異(P>0.05)。
　　6、腎移植術后病毒尿癥和病毒血癥受者在體外刺激IL-2/IFN-γ+/TNF-α+ CD4+ T細胞免疫反應強度中VP1、VP2、VP3蛋白的反應強度普遍高于LT和st蛋白,而VP1和 VP3蛋白又顯著高于 VP2蛋白(P<0.05),兩兩比較均具有統(tǒng)計學意義顯著差異(P<0.05)。
　　7、腎移植術后持續(xù)BKV病毒血癥受者易發(fā)展為BKVN,此類受者的5種BKV特異性蛋白體外刺激IL-2/IFN-

14、γ+/TNF-α+ CD4+ T細胞反應強度呈明顯下降趨勢。在持續(xù)病毒尿癥受者中未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。
　　結論:
　　1、應用我研究所自行研發(fā)的BKV DNA載量檢測試劑盒預測BKVN的指標為:尿液BKV DNA載量陽性值為107copies/ml,血漿BKV DNA載量陽性值為105copies/ml。即當檢測標本BKV DNA載量大于陽性值時可作為明確BKVN的診斷指標。
　　2、腎移植術后早期應規(guī)律定期監(jiān)測尿、血標本

15、中BKV DNA載量變化,尤其在術后6~9個月是BKV感染的高峰時段,監(jiān)測BKV感染的間隔時間最長不應超過3個月,對持續(xù)BK病毒尿癥受者必須進一步明確病毒血癥的發(fā)生。
　　3、FK506是腎移植術后BKV感染進展的獨立危險因素,對于術后高危受者可采取減免該種類藥物或更換為其他免疫抑制藥物的措施。對移植術前對供、受者進行常規(guī)的BKV篩查是預防和減少術后進展為BK病毒血癥和BKVAN的另一有效措施。對術前BKV陽性受者,術后應加大對B

16、KV感染的監(jiān)測力度,同時早期給予適當的預防性臨床干預措施。
　　4、BKV感染發(fā)展至病毒血癥階段即可能影響移植腎功能,對發(fā)現(xiàn)BK病毒血癥的受者,尤其是持續(xù)病毒血癥的受者應及時進行降低免疫抑制藥物等臨床干預,減緩進展為BKVN的幾率。
　　5、體外刺激腎移植術后受者BKV特異性細胞免疫反應以CD4+ T細胞免疫反應為主。移植受者 BKV感染發(fā)展至病毒血癥階段時,VP1、VP2、VP3三種結構蛋白體外刺激病毒特異性免疫反應的強度