1、目的：研究蛋白激酶C的亞型PKC6在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RPMVEC)中的表達(dá)，通過觀察脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RPMVEC損傷時(shí)PKC表達(dá)的變化，以及PKC6抑制劑楸毒素(Rottlerin)對(duì)單層通透性增高的干預(yù)作用。探討PKC特異性亞型在LPS誘導(dǎo)的RPMVEC損傷中的作用。 方法：在體外分離、培養(yǎng)的RPMVEC的基礎(chǔ)上進(jìn)行PKC6的Western印跡和免疫組化檢測(cè)，以及LPS作用后PKC8表達(dá)的變化。用針頭式濾器檢測(cè)LP

2、S及LPS+Rottlerin干預(yù)后RPMVEC單層濾過系數(shù)(Kf)的變化。 結(jié)果1體外成功分離培養(yǎng)RPMVEC，經(jīng)形態(tài)學(xué)、VIII因子相關(guān)抗原及FITC—BSI結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)所獲得為RPMVEC：在細(xì)胞傳代時(shí)采用含有EDTA的胰蛋白酶，縮短了消化傳代的時(shí)間，減少了傳代過程中胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的損傷；成功進(jìn)行了細(xì)胞的冷凍和復(fù)蘇，為今后的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。2首先通過采用免疫組化的方法明確了PKC6在RPMVEC中有廣泛的表達(dá)，其表達(dá)部位位于

3、胞漿。Western印跡檢測(cè)PKC6出現(xiàn)一條蛋白印跡條帶，分子質(zhì)量與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Mark相比，約為77KD，進(jìn)一步證實(shí)了PKC6在RPMVEC中存在。采用10ug／mlLPS作用RPMVEC60min后與正常對(duì)照組比較，PKC6表達(dá)明顯增高。310ug／mlLPS、5uM／LRottlerin分別作用15、30、60、90、120min，LPS組RPMVEC單層的Kf值較對(duì)照組顯著增高，Rottlerin組較對(duì)照組無明顯差異。Rott

4、lerin+LPS組各時(shí)相點(diǎn)Kf值顯著低于LPS組。 結(jié)論：1成功進(jìn)行原代培養(yǎng)RPbWEC，形態(tài)學(xué)、VIII因子相關(guān)抗原及FITC-BSI結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)所獲得為RPMVEC、并在對(duì)傳代方法改進(jìn)后成功對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷凍和復(fù)蘇。2采用免疫組化的方法證實(shí)了PKC8在RPMVEC中有表達(dá)，其表達(dá)部位在細(xì)胞漿；LPS可導(dǎo)致RPMVEC表達(dá)PKC6增高。3采用PKC6特異性抑制劑Rottlerin可部分抑制LPS導(dǎo)致的RPMVEC單層通透性增高，