1、華中科技大學博士學位論文一個新的鎘應(yīng)答原癌基因的致癌機制研究姓名：雷毅雄申請學位級別：博士專業(yè)：勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學指導教師：陳學敏20060401華中科技大學同濟醫(yī)學院博士研究生畢業(yè)論文關(guān)細胞癌基因表達的影響，及其在鎘、鎳誘發(fā)人支氣管上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的變化情況，為致癌金屬鎘等毒物的人類分子致癌機制提供新的依據(jù)，對于利用TEF16的表達改變作為金屬化學致癌新的分子生物標記物的研究也具有較高的價值和前景。2方法：21TEF16表達質(zhì)

2、粒與細胞轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達系統(tǒng)的建立在TEF16cDNA起始密碼子的5端添加核苷酸序列5CACC3’，同時去掉cDNA核苷酸序列末端的蛋白表達終止密碼子。經(jīng)修飾的TEF16的開放閱讀框架與表達載體pcDNA31N5His—TOPO的V5epitopeand6XHistag融合，構(gòu)建成TEF一16表達質(zhì)粒，再以限制性內(nèi)切酶確認。應(yīng)用磷酸鈣介導轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染CHO和COS7細胞，經(jīng)(418篩選后用Westernblot技術(shù)分析融合蛋白質(zhì)的

3、表達。因為TEF16編碼的蛋白與表達載體V5epitopeand6His所編碼的蛋白融合，所以這一融合蛋白質(zhì)可用化學發(fā)光檢測試劑盒中的V5epitope抗體與之起交叉反應(yīng)而被檢測。22TEF16轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞的轉(zhuǎn)化實驗及其惡性鑒定應(yīng)用磷酸鈣介導轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，再用Westernblot技術(shù)和化學發(fā)光檢測試劑盒分析轉(zhuǎn)染物在細胞中的瞬時表達，在此基礎(chǔ)上進行細胞轉(zhuǎn)化試驗。細胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)不超過6周，每周只換2次DME

4、M培養(yǎng)液。當轉(zhuǎn)染細胞出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)化灶時終止培養(yǎng)，以亞甲基藍染色，觀察各組細胞轉(zhuǎn)化情況。同時對TEF15轉(zhuǎn)染介導NIH3T3轉(zhuǎn)化細胞株進行軟瓊脂集落形成試驗和裸鼠成瘤實驗，以鑒定其惡性。23反義TEF18表達質(zhì)粒的構(gòu)建與細胞聯(lián)合轉(zhuǎn)染實驗把TEF16cDNA以反義方向(3’一5’)亞克隆于表達質(zhì)粒pcDNA31，、，5HisTOPO或pCIneoMammalianExpressionVector，構(gòu)建2種反義TEF16表達質(zhì)粒，并以限制性內(nèi)切

5、酶確認。聯(lián)合轉(zhuǎn)染實驗就是觀察反義TEF16表達質(zhì)粒，通過聯(lián)合轉(zhuǎn)染Nq／13T3細胞可否抑制TEF16編碼蛋白表達。在各實驗組中，隨機選取l瓶細胞進行Westernblot分析以觀察聯(lián)合轉(zhuǎn)染細胞后的瞬時表達，并用透光掃描軟件進行半定量；同時將其余平行細胞進行聯(lián)合轉(zhuǎn)染細胞的轉(zhuǎn)化試驗，分析各組細胞的轉(zhuǎn)化情況。24反義TEF1／imRNA逆轉(zhuǎn)鎘轉(zhuǎn)化細胞致癌性的試驗將反義TEF16表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CdCh轉(zhuǎn)化BALB／c3T3細胞，經(jīng)G418篩選，構(gòu)