1、目的：遲緩愛德華菌(Edwardsiella trada，簡稱Et)是在水產養(yǎng)殖中重要的病原菌，能引起多種水產養(yǎng)殖動物，如魚類、鰻魚、龜鱉、牛蛙等的疾病。遲緩愛德華菌還是一種人畜共患病的病原菌，是愛德華菌屬中唯一感染人的成員。預防和治療水產養(yǎng)殖動物遲緩愛德華菌感染主要使用抗生素，這涉及到食品的安全問題。接種疫苗作為一種安全可靠的預防手段，已得到大家的公認，但目前尚無有效疫苗的應用。盡管已發(fā)現(xiàn)Et的一些重要的致病因子，如溶血素、載鐵體、腸

2、毒素等，但其致病機理仍不明確。因此，對遲緩愛德華菌的毒力因子及其調控的進一步研究，有助于發(fā)現(xiàn)新的致病機制和疫苗靶點。本實驗旨在研究Et溶血素活化基因(Et haemolysin activator gene，eha)的生物學特性和調控作用，并構建其缺失株。 方法：構建重組載體pET28a<'+>.eha，轉化大腸埃希菌BL21，利用IPTG誘導大腸埃希菌表達EHA蛋白，菌體超聲裂解物經Ni-NTA親和層析柱純化后，檢測其純化蛋白

3、溶血活性及Vero細胞毒性。將eha重組質粒pED101和載體pACYC184分別轉入大腸埃希菌DH 5α中，利用RT-PCR及SDS-PAGE電泳，觀察eha基因調控大腸埃希菌染色體上的細胞毒clyA基因的轉錄和表達。構建eha基因重組自殺質粒，利用同源重組原理，缺失Et的eha基因，并用PCR證實。 結果：成功構建了pET28a<'+>-eha重組質粒，經IPTG誘導后，SDS-PAGE電泳顯示表達出一條17 kDa左右的條

4、帶，純化蛋白無溶血性及Vero細胞毒性。將eha重組質粒pEDl01轉化入大腸埃希菌DH 5α中，其克隆子表現(xiàn)出溶血性，SDS-PAGE電泳顯示克隆子有一條30 kDa左右的蛋白條帶，與clyA蛋白分子量一致，RT-PCR顯示其有約1000 bp的條帶，也與clyA符合，而載體pACYC184轉化入大腸埃希菌DH 5α中，其克隆子無溶血性，SDS-PAGE電泳和RT-PCR均未顯示相應的條帶。成功構建了eha基因重組自殺質粒，通過電轉，