1、目的: 先天性心臟?。–HD）是人類一種非常普遍和具有破壞性的出生缺陷性疾病，其發(fā)生與gata4基因突變有關。gata4參與調控心肌細胞中某些特定基因的表達，對心肌細胞的形成、心臟前體細胞的遷移和分化、心瓣膜及間隔發(fā)育等具有重要作用?；蚯贸夹g構建gata4基因敲除的動物模型有助于人類先天性心臟病致病機制和治療的進一步研究。類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)介導的靶向修飾技術是目前廣泛使用的成熟的基因敲除技術，它主要含有兩個重要

2、的結構域:特異性識別核酸的靶點識別域和切斷DNA序列的核酸酶功能結構域。人工構建針對gata4基因第一外顯子的重組核酸酶TALEN，在體內對特定位點產生DNA雙鏈斷裂，利用細胞自身DNA損傷后的NHJE引入基因突變、敲除或敲入，實現(xiàn)基因定點修飾的目的，并建立斑馬魚先天性心臟病gata4基因敲除的動物模型。
　　方法: 采用生物信息學方法分析斑馬魚gata4基因的編碼序列，利用靶位點設計軟件選擇合適的打靶位點，針對第一外顯子設計了一

3、對靶點。使用單元組裝法克隆構建特異性TALE靶點結合域，組裝完成后通過菌液PCR、測序驗證TALE是否組裝正確。將TALE靶點結合域克隆到真核表達載體pCS2-PEAS和pCS2-PERR中，得到gata4基因的左、右半位點的重組核酸酶質粒，通過菌液PCR、酶切、測序驗證打靶載體是否正確。線性化打靶載體DNA，使用SP6體外轉錄試劑盒將其轉錄成mRNAs，通過顯微注射的方式注入斑馬魚單細胞期受精卵中，酶切法檢測TALEN的體內活性。待注

4、射的斑馬魚性成熟后，通過逐條剪尾、酶切檢測發(fā)生基因突變的斑馬魚，TA克隆測序確認突變體的基因型，篩選出gata4基因敲除的斑馬魚。
　　結果: 菌液PCR、酶切、測序結果均證實成功地構建出了正確的針對gata4第一外顯子左、右半位點的重組核酸酶，斑馬魚胚胎體內活性檢測發(fā)現(xiàn)TALEN的效率為35.18％，通過逐條剪尾、PCR、酶切法檢測成功地篩選出了19條gata4基因發(fā)生突變的斑馬魚，測序結果顯示斑馬魚突變體產生了不同片段大小、不