1、目的：
　　1.觀察高糖對成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡和炎癥的影響;
　　2.驗證bFGF對高糖抑制的成纖維細(xì)胞增殖及高糖誘導(dǎo)的凋亡炎癥保護作用;
　　3.驗證高糖損抑制成纖維細(xì)胞遷移是否通過抑制bFGF調(diào)控的JNK信號;
　　4.鑒定bFGF保護高糖損傷的細(xì)胞是否通過抵制特殊蛋白的硝基化修飾;
　　方法：
　　1.設(shè)置不同濃度血清的不同濃度高糖培養(yǎng)基，添加不同濃度bFGF作用不同時間，用CCK-8檢測細(xì)

2、胞增殖情況，用wester-blot檢測細(xì)胞內(nèi)凋亡炎癥蛋白表達(dá)情況;
　　2.使用FGFR1抑制劑PD173074抑制bFGF信號，用細(xì)胞刮痕遷移實驗檢測bFGF和高糖對細(xì)胞遷移的影響，用wester-blot檢測細(xì)胞內(nèi)凋亡炎癥蛋白表達(dá)及bFGF調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白.JNK和AKT的表達(dá);
　　3.用激活的Rac1檢測試劑盒檢測高糖及bFGF對細(xì)胞內(nèi)激活的Rac1的表達(dá);
　　4.用MDA檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒和wes

3、ter-blot實驗，分別檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物、氧自由基、硝基化酪氨酸的表達(dá)水平;
　　5.液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜(LC/MC)鑒定分析酪氨酸硝基化水平表達(dá)差異大的特殊蛋白;
　　6.超氧化物歧化酶模擬劑MnTMPyP清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，wester-blot實驗檢測AnnexinA2的硝基化水平;
　　7.使用JNK和FGFR1抑制劑SP600125和PD173074分別抑制JNK和FGFR1活性，用細(xì)胞刮痕遷移實驗檢測

4、JNK對細(xì)胞遷移的影響;
　　8.高糖對細(xì)胞形態(tài)影響，用倒置顯微鏡直接鏡下觀察，并拍照記錄，用wester-blot實驗檢測高糖對纖維化相關(guān)因子表達(dá)影響。
　　結(jié)果：
　　1.在高糖對成纖維細(xì)胞增殖影響實驗中，發(fā)現(xiàn)用高血清10％的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，不影響細(xì)胞增殖，而用極限條件的低血清(0.35％)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞在15 mM的糖濃度細(xì)胞即發(fā)生明顯的增殖抑制。bFGF可以促進高糖損傷的成纖維細(xì)胞恢復(fù)增殖;
　　2

5、.在檢測高糖對細(xì)胞內(nèi)凋亡炎癥的影響實驗中發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)凋亡炎癥蛋白(P53、C-Caspase3、TNF-α和PAI-1)的表達(dá)，bFGF可以抵制這種現(xiàn)象;
　　3.活性Rac1蛋白的檢測實驗中發(fā)現(xiàn)，bFGF可以激活人成纖維細(xì)胞中Rac1表達(dá)，但與低糖組別相比，高糖或添加FGFR1抑制劑的組別的表達(dá)沒影響;
　　4.實驗發(fā)現(xiàn)高糖引起脂質(zhì)氧化物、ROS和RNS的水平異常增高并抑制JNK的磷酸化，bFGF可以激活JNK磷酸

6、化并促進成纖維細(xì)胞遷移，用JNK抑制劑后顯著抑制細(xì)胞遷移;
　　5.在液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜(LC/MC)鑒定表達(dá)差異大硝基化酪氨酸條帶的實驗中，發(fā)現(xiàn)鑒定出的其中之一的Annexin A2蛋白與細(xì)胞遷移有關(guān);
　　6.添加FGFR-1或JNK抑制劑會增加Annexin A2蛋白硝基化水平，而bFGF可以翻轉(zhuǎn)高糖介導(dǎo)的增高的Annexin A2硝基化。抑制FGFR-1信號還會抵制bFGF激活的JNK;
　　7.在觀察高糖對細(xì)胞

7、形態(tài)和纖維化相關(guān)因子表達(dá)影響的實驗中，發(fā)現(xiàn)高糖損傷3天，引起纖維化相關(guān)因子表達(dá)紊亂，但對細(xì)胞形態(tài)影響不大。
　　結(jié)論：
　　本實驗我們使用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)提取的原代人包皮成纖維細(xì)胞，體外模擬糖尿病高糖環(huán)境，研究糖尿病對創(chuàng)面愈合影響的分子機制。
　　實驗顯示常規(guī)30 mM高糖環(huán)境培養(yǎng)成纖維細(xì)胞抑制細(xì)胞遷移，但不影響細(xì)胞增殖。bFGF的強烈促遷移作用，援救了高糖對成纖維細(xì)胞的遷移損傷作用。
　　分子和細(xì)胞生物學(xué)研究顯示

8、，高糖增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平，抑制JNK磷酸化，并且對Rac1活性表達(dá)沒影響。bFGF調(diào)控細(xì)胞遷移時，需要激活JNK和Rac1。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)研究鑒定高糖增加的成纖維細(xì)胞內(nèi)特殊蛋白Annexin A2的硝基化修飾水平，并且bFGF信號的激活可以抵制高糖引起的硝基化加重。添加FGFR和JNK抑制劑，延遲成纖維細(xì)胞遷移，增加Annexin A2硝基化，表明Annexin A2受bFGF信號調(diào)節(jié)，通過激活JNK。
　　總的來說，高