1、Graves病(Graves'disease,GD)是由促甲狀腺激素(Thyroid stimulating hormone,TSH)受體刺激性抗體(Thyroid-stimulating antibody,TSAb)引起的,這種抗體與TSH競爭結合于TSH受體(TSH receptor,TSHR),模擬TSH的作用促進甲狀腺細胞分裂(導致甲狀腺腫),并促進甲狀腺激素分泌。除了環(huán)境和遺傳因素外,免疫缺陷也在GD發(fā)病中發(fā)揮重要作用。雖然早

2、前研究已經證實GD患者血清中的TSAb是輔助性T細胞依賴性的,但針對TSHR的自身耐受是如何被打破的,以及自身抗體產生的潛在機制并不清楚。在自身免疫性疾病(包括GD)中,許多研究認為打破中樞和外周免疫耐受產生自身抗體是由于免疫調節(jié)缺陷所造成。調節(jié)性T淋巴細胞(Regulatory T lymnphocyte,Treg)在防止自身免疫性疾病的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用,其主要通過抑制自身反應性T細胞增殖、促發(fā)其失活而維持機體的穩(wěn)態(tài)。新近研究提示

3、,除致病性B細胞外,還存在能產生白細胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)或轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)等細胞因子的調節(jié)性B淋巴細胞(Regulatory B lymnphocyte,Breg),主要包括CD1dhiCD5+CD19hi表型。Breg通過產生抑制性細胞因子或分泌抑制性抗體,影響其它免疫細胞,減緩炎癥癥狀。
　　 目的：本研究旨在觀

4、察GD患者和對照組外周血單個核細胞Treg、Th17、Breg水平的變化,探討GD的發(fā)病機制。
　　 方法：明確診斷為Graves病的初發(fā)患者20人,同期選取年齡性別匹配的健康對照20人。采集空腹血液標本,空腹靜脈促凝血分離血清,測定甲狀腺功能[TSH、FT4(Free thyroxine)]和甲狀腺自身抗體[甲狀腺過氧化物酶抗體(Thyroid peroxidaseantibody,TPOAb)、甲狀腺球蛋白抗體(Thyrog

5、lobulin antibody,VgAb)和TSAb]?？崭轨o脈抗凝血用于分離單個核細胞,免疫熒光染色,流式細胞分析檢測外周血單個核細胞(Peviphary blood monolueclear cell,PBMC)中Treg、Th17、Breg細胞水平。實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(Quantitative Real-Time Reverse TranscriptePolymerase Chain Reaction,real-time

6、 RT-PCR)法檢測Treg的轉錄因子叉頭蛋白P3(forkhead box P3,Foxp3)、Th17的轉錄因子視黃酸受體相關孤兒受體γt(Retinoicacid receptor-related orphan receptorVt,RORγt)、白細胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)和IL-10的mRNA水平。所有數(shù)據(jù)輸入SPSS16.0。P＜0.05判定為具有顯著性差異。
　　 結果：
　

7、　 1.Graves病患者CD4+CD25+Foxp3+T細胞百分比與對照組比較明顯降低,IL-17+T細胞百分比與對照組比較明顯升高,CD1dhiCD5+CD19hiB細胞百分比與對照組比較明顯降低。
　　 2.GD患者及對照組外周血單個核細胞Th17細胞比例與血清TSAb呈正相關,Treg、Breg細胞比例與TSAb分別呈負相關。
　　 3.Graves病患者的Foxp3、IL-10 mRNA表達量低于對照組,而其

8、RORγt和IL-17mRNA表達量顯著高于對照組。
　　 結論：Graves病患者外周血細胞中CD4+CD25+Treg細胞比例及其轉錄因子Foxp3mRNA表達水平均明顯減少,CD1dhiCD5+Bregs細胞比例及其主要分泌細胞因子IL-10 mRNA表達水平均明顯減少,而Th17細胞比例及其轉錄因子RORγt mRNA表達水平均明顯增多。提示Graves病可能與調節(jié)性T細胞和調節(jié)性B細胞比例降低,而致病性的Th17細胞比

9、例增多有關。
　　 背景：理想動物模型的建立是深入研究疾病的發(fā)病機制、探索有效治療措施的途徑之一。但迄今為止還沒有發(fā)現(xiàn)自發(fā)的Graves病(Graves'disease,GD)動物模型。1996年,Shimojo第一次建立了GD的動物模型。此后,研究者相繼建立了不同的GD動物模型。GD由TSHR抗體介導產生,因此一直以來被認為是輔助性T細胞2(Helper T cell2,Th2)型自身免疫病。然而,在人和動物中這一觀點一直被質

10、疑,認為GD可能并非由經典輔助性T細胞1(Helper T cell1,Th1)/Th2免疫反應所致,有其他免疫反應[如分泌白細胞介素17的輔助性T細胞0nterlettkin-17secreting helper T cells,Th17)]型免疫反應存在。研究表明Th17參與人類自身免疫病的發(fā)生發(fā)展,如類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)、多發(fā)硬化(Multiple sclerosis,MS)、1型糖尿病(

11、Type1 diabetes mellitus,T1DM)及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)等。RA的血清和關節(jié)滑液中IL-17含量很高;MS病變組織的IL-17 mRNA升高18倍;缺失IL17+T細胞可以使實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物模型(Experimental allergic encephalomyelitis,EAE)等自身免疫病的發(fā)病受到抑制:IL-17過表達可促進SLE發(fā)

12、展,而將IL-17受體敲除則降低SLE嚴重程度。自發(fā)自身免疫甲狀腺炎動物模型NOD.H2h4小鼠的脾和甲狀腺內Th17細胞增多,IL-17基因敲除小鼠可抵抗高碘誘導的甲狀腺炎。這些結果提示干預Th17細胞免疫途徑可能成為自身免疫病治療的新靶點。一篇發(fā)表于2009年6月的《science》雜志上的文章認為溴氯哌喹酮(Halofuginone,HF)可以抑制Th17細胞的分化,而不改變其他正常免疫細胞,減輕自身免疫反應,從而減輕了EAE的發(fā)

13、病。因此HF可能在Th17細胞致病的自身免疫病中發(fā)揮治療作用。
　　 目的：本研究以TSHRA亞單位-腺病毒(Adenovirus,Ad)載體注射誘導小鼠Graves病動物模型,探討GD模型發(fā)病中Th17細胞、調節(jié)性T細胞的變化,以及溴氯哌喹酮(HF)干預對Graves病模型發(fā)病及免疫狀態(tài)的影響。
　　 方法：在人胚腎293(Human embryonic kidney293,HEK293)細胞內擴增TSHR A亞單位-

14、腺病毒(Ad-TSHRA)及空載腺病毒(Ad-con)對照,病毒純化,測定病毒滴度。選擇6周齡BALB/c雌鼠,在中國醫(yī)科大學實驗動物中心無特定病原體(Speeefic pathogen Free,SPF)級環(huán)境下飼養(yǎng)。將實驗動物隨機分為4組,每組15只動物。分組如下:
　　 1.Graves病模型組:肌注TSHR A亞單位-腺病毒,每三周免疫一次,共免疫三次,第三次免疫后三周處死。
　　 2.正常對照組:在相同的環(huán)境下

15、,相同時間次數(shù)給予空載腺病毒。
　　 3.Graves病溴氯哌喹酮干預組:肌注TSHR-A亞單位腺病毒造模的同時,腹腔注射溴氯哌喹酮2μg日/鼠[溴氯哌喹酮溶于二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)中]。
　　 4.Graves病溴氯哌喹酮干預對照組:肌注TSHR-A亞單位腺病毒建立GD模型的同時,僅肌注DMSO0.2μl/H/鼠。
　　 留取血清,化學發(fā)光法檢測小鼠游離甲狀腺素(Free

16、thyroxine,FT4):促甲狀腺激素受體刺激性抗體(Thyroid-stimulating hormone antibody,TSAb)測定:使用穩(wěn)定表達全長血清促甲狀腺激素受體(Thyroid Stimulating Hormone Receptor,TSHR)的中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)細胞,加入稀釋鼠血清,37℃培養(yǎng)。使用環(huán)磷酸腺苷(Cyclic adenosine monopho

17、sphate,cAMP)放射免疫分析(Radioimmunoassay,RLA)試劑盒檢測釋放到培養(yǎng)液中的cAMP濃度。取完整甲狀腺組織,多聚甲醛固定制作石蠟切片蘇木素和伊紅(Hematoxylin and eosin,HE)染色。取脾制成單細胞,免疫熒光染色、流式細胞學檢測Treg、Th17細胞。實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(Quantitative Real-Time Reverse Transeripte PolymeraseCha

18、in Reaction,real-time RT-PCR)法檢測叉頭蛋白P3(forkhead box P3,Foxp3)、視黃酸受體相關孤兒受體γt(Retinoic acid receptor-related orphan receptor,RORγt)和白細胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)的信使核糖核酸(Messenger ribouncleicacid,mRNA)水平。
　　 結果：
　　

19、 1、血清FT4和TSAb以Ad-con免疫對照組小鼠-x+3s為正常上限,Ad-con免疫對照組FT4為5.154±0.62 pmol/l,TSAb為(99.4±14.95)％。因此,當小鼠血清FT4＞7.01 pmol/l,TSAb大于144.25％為陽性。Ad-TSHRA組中共15只小鼠,其中10只小鼠血清FT4水平高于正常,11只TSAb高于正常。TSAb與T4呈顯著正相關(r=0.843,p＜0.01)。
　　 甲狀腺

20、組織HE染色,光鏡下顯示:對照組小鼠甲狀腺濾泡大小較一致,細胞排列比較疏松,上皮細胞呈低立方狀或扁平狀,濾泡中膠質含量比較豐富。Ad-TSHRA造模成功組小鼠甲狀腺濾泡細胞增生肥大,呈立方狀或高柱狀,濾泡大小不一,濾泡腔中膠質含量減少,在增生的甲狀腺濾泡中有乳頭狀折疊凸入濾泡腔,未見淋巴細胞浸潤。
　　 2、Ad-TSHRA造模+DMSO組中15只小鼠,其中10只小鼠血清FT4水平高于正常,10只TSAb高于正常。Ad-TSHR

21、A造模溴氯哌喹酮干預組GD發(fā)病率為10/15,與未干預組發(fā)病率無差異。在Ad-TSHR A+DMSO以及Ad-TSHRA+HF組中,甲狀腺組織病理學與Ad-TSHRA免疫GD造模組未見明顯差異。
　　 3、Ad-TSHRA免疫GD造模組和Ad-TSHRA+DMSO組小鼠脾臟Treg細胞比例低于Ad-con免疫組,同時小鼠脾臟Foxp3 mRNA水平亦低于Ad-con組(p＜0.05)。Ad-TSHRA免疫GD造模+HF干預組中,

22、小鼠脾臟Tregs細胞比例及小鼠脾臟Foxp3 mRNA表達均高于GD模型無HF干預組(p＜0.05)。
　　 4、無論GD模型組、非GD對照組以及HF干預后的GD模型組小鼠脾臟Th17細胞比例及小鼠脾臟RORγt、IL-17 mRNA表達均未見明顯差異(p＞0.05)。
　　 結論：
　　 1、以TSHRA亞單位.腺病毒免疫6周齡BALB/c雌性小鼠成功建立了Graves病動物模型,成模率66.7％。Grave

23、s病小鼠脾細胞中Treg細胞比例降低,Treg細胞的轉錄因子Foxp3 mRNA表達減少,Th17細胞比例和Th17轉錄因子RORγt及IL-17 mRNA表達未見明顯改變,提示Treg異?；騎reg與Th17的表達失衡可能參與GD模型的發(fā)病。
　　 2、溴氯哌喹酮干預未減少BALB/c小鼠Graves病發(fā)病率,但增加了小鼠脾臟內Treg細胞比例和Treg轉錄因子Foxp3 mRNA表達,但并未改變Th17細胞比例,Th17轉錄