1、氯離子是機體內最重要，最豐富的陰離子，而主要介導這一離子流動的容積敏感性外向整流性（volume-sensitiveoutwardlyrectifying，VSOR）Cl-通道不僅參與了細胞容積的調節(jié)、細胞的增殖、分化與凋亡以及動作電位的產生等多種生理、病理過程，而且在細胞凋亡相關的疾病，如心力衰竭、心肌梗死及心律失常等多種心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著至關重要的作用。
　　凋亡又稱程序性細胞死亡（programmedcellde

2、ath，PCD），細胞凋亡早期細胞體積減小即凋亡性容積減?。╝poptoticvolumedecrease，AVD），是凋亡的一個重要的形態(tài)學特征。近年來，大量證據(jù)提示AVD及激活的氯離子通道在細胞凋亡過程中起著重要的作用，是細胞凋亡的重要前提；多種細胞類型在多種凋亡刺激的情況下，其中包括凋亡受體介導的細胞外途徑和線粒體介導的細胞內途徑，通過阻斷激活的VSORCl-通道及細胞體積減小可以抑制細胞凋亡，膜片鉗實驗同樣證實細胞凋亡伴有容積敏

3、感性氯電流（volume-sensitiveCl-current，ICl,Vol）或膨脹激活性氯電流（swelling-activatedCl-current，ICl,Swell）的激活，阻斷激活的該氯電流能抑制或減輕細胞凋亡，但是其內在的信號機制尚不清楚。十字孢堿（staurosporine，STS）是一種蛋白激酶C（PKC）的抑制劑，我們前期應用分子生物學的實驗研究已經證明了STS誘導的心肌細胞凋亡過程中，VSORCl-通道阻斷劑能

4、夠有效抑制心肌細胞的凋亡，且PI3K/Akt（phosphatidylinositol3-kinase/proteinkinaseB，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B）信號分子參與了保護心肌細胞的機制。但是尚缺乏電生理研究的直接證據(jù)，這正是本研究的目的。
　　研究目的：
　　1.在心肌細胞上應用全細胞膜片鉗技術觀察STS是否能夠誘導產生ICl,Vol電流及其電生理學特性。
　　2.觀察氯離子通道阻斷劑DIDS及特異性VS

5、ORCl-通道阻滯劑DCPIB對STS誘導該電流產生的影響。
　　3.通過應用PI3K/Akt信號分子的特異性抑制劑LY294002及其激動劑Insulin，觀察PI3K/Akt信號分子是否參與了STS誘導ICl,Vol電流的調控。
　　研究方法：
　　1.原代培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細胞，實驗設立陰性對照組（等滲組），正常對照組（低滲組），陽性對照組（STS組），及實驗組（低滲+DIDS/DCPIB組，STS＋DIDS/

6、DCPIB組，STS+LY294002/Insulin組）。每組相同實驗重復5個細胞及以上。
　　2.應用全細胞膜片鉗技術，記錄低滲液灌流心肌細胞后ICl,Vol電流的特征及兩種氯通道阻斷劑DIDS和DCPIB對該電流的影響。
　　3.應用全細胞膜片鉗技術，記錄含STS的等滲液灌流心肌細胞后氯電流的特征及兩種氯通道阻斷劑DIDS和DCPIB對該電流的影響。
　　4.PI3K/Akt信號分子特異性抑制劑LY294002及

7、其激動劑Insulin預處理30min后，進行全細胞膜片鉗記錄，方法同上，觀察二者對STS誘導氯電流產生的影響。
　　研究結果：
　　1.實驗結果證實在220毫滲單位（Osmol/kgH2O）低滲液灌流心肌細胞可產生ICl,Vol電流，當去極化電壓達到+80mV時即出現(xiàn)時間依賴性失活，+100mV時的電流密度為19.45±1.76pA/pF（n=5），在+40mV，+60mV，+80mV及+100mV時均可被DIDS和DCP

8、IB呈電壓依賴性阻斷，I/V曲線圖顯示該電流呈現(xiàn)外向整流性。
　　2.首次在心肌細胞膜記錄到STS（4μmol/L）誘導產生的氯電流，呈現(xiàn)類似ICl,Vol電流的電生理學特性：外向整流性、高正電壓處呈現(xiàn)時間依賴性失活、氯通道阻斷劑的敏感性，符合ICl,Vol電流的特征。+100mV時的電流密度為18.73±2.32pA/pF（n=5，P>0.05，STS組vs．低滲組），應用DIDS（500μmol/L）和DCPIB（10μmol

9、/L）能夠顯著地抑制該氯電流的產生，在+100mv時，二者對STS誘導氯電流的抑制率分別為92.6％±7.3％（n=5，P<0.01，STS+DIDS組vs．STS組）和78.4％±5.5％（n=5，P<0.01，STS+DCPIB組vs．STS組），且二者存在明顯差異（n=5，P<0.01，STS+DIDS組vs．STS+DCPIB組），支持該氯電流是以ICl,Vol電流為主的氯電流。
　　3.PI3K/Akt信號分子的特異性抑

10、制劑LY294002（20μmol/L）易化了STS誘導ICl,Vol電流的產生，+100mV時的電流密度為19.54±2.70pA/pF（n=5，P>0.05，STS+LY294002組vs．STS組），但較單純STS誘導的電流時間顯著縮短（n=5，P<0.01，STS+LY294002組vs．STS組）；PI3K/Akt信號分子的激動劑Insulin（100nmol/L）則抑制了STS誘導ICl,Vol電流的產生，+100mV時的電

11、流密度為15.40±2.13pA/pF（n=6，P<0.01，STS+Insulin組vs．STS組和STS+LY294002組），提示PI3K/Akt信號分子參與了STS誘導ICl,Vol電流的調控。
　　結論：
　　1.低滲可以誘導心肌細胞產生ICl,Vol電流，即呈現(xiàn)外向整流性，高正電壓處呈時間依賴性失活，可被氯通道阻斷劑DIDS和DCPIB所阻斷。
　　2.STS也可以誘導心肌細胞產生類似ICl,Vol電流，其