1、研究目的：
　　 研究人原代晶狀體上皮細胞中PEDF基因表達與波形蛋白和αB-晶狀體蛋白的關系。
　　 材料和方法：
　　 眼組織來源：人尸體眼球來源于中山眼科中心眼庫。所有與尸體解剖相關性的研究均已通過中山大學人文倫理委員會的許可。我們所有的研究均遵照政府及相關公共組織的關于人類及動物實驗倫理道德條款。
　　 人晶狀體原代上皮細胞的培養(yǎng)：晶狀體上皮細胞貼敷于尸體眼的晶狀體前囊膜下。在解剖顯微鏡下，撕取晶

2、狀體的前囊膜，平鋪于培養(yǎng)皿底部，上皮細胞面向上。滴取一滴胎牛血清與上皮細胞面，保持細胞面的濕潤。放于37℃0.5％CO2的培養(yǎng)箱孵育2小時，使前囊膜充分貼敷于培養(yǎng)皿的底部。用含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
　　 采用GenScript's siRNA design center siRNA Target Finder和siRNA ConstructBuilder軟件設計三個shRNA序列，用于人PEDF基因

3、的RNA干擾。運用標準的分子生物學技術將這些寡核苷酸序列克隆到質粒載體SD1211上。然后通過Gateway技術將設計的寡核苷酸序列克隆到pLenti6/V5-D-TOPO質粒載體中，用于慢病毒的產(chǎn)生。在用慢病毒感染細胞48小時后，用RNeasy plus Mini kit提取細胞中的總RNA。做三次重復的實時定量多聚酶鏈式反應(Real-time PCR)。實驗中我們采用家族管理基因GAPDH作為對照基因。用△△Ct得出不同組PEDF

4、基因RNA水平含量的差別。人原代晶狀體上皮細胞PEDF基因RNA干擾48小時后，Western Blot方法檢測其中波形蛋白以及αB-晶狀體球蛋白表達水平的變化。
　　 結果：
　　 人晶狀體原代上皮細胞的培養(yǎng)：
　　 帶有晶狀體上皮細胞的人晶狀體前囊膜完整的貼敷于培養(yǎng)皿上，24小時觀察到健康的晶狀體上皮細胞貼敷于前囊膜上，5天后晶狀體上皮細胞溢出囊膜范圍，遷移到培養(yǎng)皿上。10天后，培養(yǎng)皿上上皮細胞達到70％-8

5、0％的融合，并且呈現(xiàn)出正常的上皮源性細胞的形態(tài)特征。
　　 慢病毒感染人原代晶狀體上皮細胞：鑒于普通質粒轉染技術在原代上皮細胞上的成功率比較低，所以我們構建了慢病毒載體結構來表達shRNA，以達到對PEDF基因下調的目的。同時我們在構建的shRNA結構中表達綠色熒光(GFP)片斷，以便于觀察感染的效率。在熒光顯微鏡下，對感染48小時后的細胞照相，我們發(fā)現(xiàn)每一組的感染率都在80％左右。
　　 shRNA作用下PEDF基因被

6、下調的效果鑒定
　　 表達相應shRNA的慢病毒感染人晶狀體原代上皮細胞48小時后，收集細胞，提取RNA。用定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)檢測PEDF基因mRNA水平的表達變化。最終發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)任何慢病毒感染的對照組，以及表達非特異性隨機序列shRNA(scramble group)的慢病毒組PEDF的mRNA在大致相同的表達水平。其余的三種針對于PEDF基因進行特異性RNA干擾的慢病毒組，其PEDF的RNA水平

7、與對照組以及scramble組比較均有顯著的下調(p＜0.01)。PEDF基因被干擾后波形蛋白以及αB-晶狀體球蛋白含量的變化
　　 用Western Blot的方法檢測對PEDF基因進行RNA干擾48小時后波形蛋白以及αB-晶狀體球蛋白含量的變化。用GAPDH作為內參基因。與未經(jīng)感染的對照組比較，αB-晶狀體球蛋白的表達量在shRNA-scramble組中增加～30％，在shRNA-1試驗組明顯增加～219％，在shRNA-2

8、試驗組增加～204％，在shRNA-3試驗組增加～93％.波形蛋白的表達量在shRNA-scramble試驗組組中降低約～13％在shRNA-1試驗組中明顯降低約～72％，shRNA-2試驗組中降低～79％，在shRNA-3試驗組中降低～93％.這項試驗結果顯示在特異性針對PEDF基因進行RNA干擾的試驗組(shRNA2，shRNA3和shRNA4)，波形蛋白的表達量明顯降低，而αB-晶狀體球蛋白的表達量卻顯著升高(P＜0.05).(O