1、無神經節(jié)細胞性巨結腸?。╝ganglionic megacolon）又稱Hirschsprung氏?。℉irschsprung's disease，HD），是一種嚴重危害嬰幼兒健康的先天性畸形，據統(tǒng)計，其發(fā)病率高達1/3000～1/5000，居消化道畸形第二位。先天性巨結腸的主要病理變化是一段結腸壁內缺乏神經節(jié)細胞，致使該段結腸持續(xù)性痙攣，腸腔狹窄，其近端腸腔擴張，內容物潴留。目前，有關先天性巨結腸的發(fā)病機制尚不完全清楚，多數觀點認為該

2、病屬于多因子遺傳性疾病，即由遺傳和環(huán)境因素共同作用所致。先天性巨結腸的主要臨床表現是腹脹、頑固性便秘、不完全性腸梗阻。目前臨床上唯一有效的治療方法是手術，但由于手術損傷比較大和結腸縮短，術后常出現小腸結腸炎、稀便、患兒心理障礙等后遺癥。因此，有人嘗試進行了神經干細胞移植治療無神經節(jié)細胞性巨結腸病的實驗研究，即用各種來源的神經干細胞移植入缺少神經節(jié)細胞的病變腸壁內。雖然移植進去的神經干細胞可以在腸壁的微環(huán)境中存活，并分化為功能性的腸神經細

3、胞，但只是部分恢復了無神經節(jié)細胞腸段的運動功能。這說明在先天性巨結腸的發(fā)病機制中除了神經節(jié)細胞缺如之外，還有其他因素的參與，其中腸壁中的Cajal間質細胞引起了人們的關注。 Cajal間質細胞（interstitial cells of Cajal，ICCs）是分布在胃腸道內由中胚層間充質細胞分化而來的一類細胞，由西班牙神經解剖學家Cajal在1893年首次描述。它既不是神經元，也不是神經膠質細胞，更不是平滑肌細胞，而是具有獨立

4、功能的特殊間質細胞。目前Cajal間質細胞的生物學特性和特殊功能越來越受到國內外學者的關注。研究發(fā)現，這類細胞是胃腸道平滑肌的起搏細胞，能產生生理慢波，并參與電活動的擴布，從而調控胃腸道平滑肌的舒縮和蠕動，其數量減少或缺失與多種胃腸動力性疾病的發(fā)生密切相關。先天性巨結腸病屬胃腸動力性疾病之一，Cajal間質細胞的異常與先天性巨結腸的發(fā)病也必然存在一定的相關性。揭示Cajal間質細胞的異常與先天性巨結腸病發(fā)病的相關關系，可進一步闡明無神經

5、細胞性巨結腸病的發(fā)病機理，并為先天性巨結腸病的細胞替代治療提供實驗依據。 根據上述理念，我們對Cajal間質細胞與先天性巨結腸病的相關性進行了比較深入的研究，論文發(fā)表于Neuroscience Letters雜志，實驗分為三個部分： 第一部分大鼠結腸Cajal間質細胞的分離與培養(yǎng) 為了更好地從形態(tài)上識別Cajal間質細胞和利用特異性表面抗原準確地鑒別Cajal間質細胞，從而為下一步的研究奠定基礎，我們對大鼠結腸壁

6、內的Cajal間質細胞進行了分離和體外培養(yǎng)。體外細胞培養(yǎng)，是研究細胞功能以及相應細胞信號轉導機制的基礎，也有利于更深入地掌握疾病本質，制定合理有效的防治措施。但是由于Cajal間質細胞的數量少，分散在結締組織、神經纖維及平滑肌等組織之中，分離提取的難度較大。對于這類細胞的體外培養(yǎng)，由于無這樣的經驗可循，因而難度更大。我們采用膠原酶及胰酶酶解和密度梯度離心法，經過多次調配兩種酶的濃度和作用時間，成功地對Cajal間質細胞進行了分離。分離出

7、細胞后，將細胞懸液接種于含有干細胞因子（stem cell factor，SCF）的M199培養(yǎng)基中，進行培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，ICCs即可貼壁生長，培養(yǎng)3天后，可分辨出ICCs形態(tài)，胞體呈三角形或梭形，有少量突起，核大。培養(yǎng)5天后，ICC形態(tài)更為清晰，自胞體發(fā)出的突起向周圍伸長，相鄰細胞胞體伸出的突起相互靠近。培養(yǎng)7天后，相鄰ICC突起間有連接形成，細胞間彼此聯系，突起相互交織，形成網絡狀結構。細胞培養(yǎng)穩(wěn)定后，用Cajal間質細胞的特

8、異性標志物c-kit進行免疫細胞化學染色，結果顯示Cajal間質細胞呈陽性著色。 第二部分小兒結腸壁內Cajal間質細胞的正常分布模式的檢測 研究表明，從小鼠的胚胎時期直至出生后，Cajal間質細胞在胃腸道內有一個不斷發(fā)育成熟的過程，并形成不同的亞型。根據Cajal間質細胞在胃腸道內分布部位的不同，通常將其分為三個亞型，即位于腸壁粘膜下層的粘膜下ICCs，稱為IC-SM；位于縱行肌與環(huán)形肌之間的肌間ICCs，稱為IC-M

9、Y；位于肌層內的肌內ICCs，稱為IC-IM。有關小兒結腸壁內的三種亞型的Cajal間質細胞的正常分布狀況及其功能至今仍未見報道?；诖?，我們收集臨床手術切除的小兒正常結腸標本，用小鼠抗人c-kit單克隆抗體（CD117）作標記，免疫組織化學染色，熒光顯微鏡檢測了結腸標本冰凍切片中ICCs的分布狀況，觀察了三種亞型的ICCs在小兒正常結腸壁中的分布狀況，結果顯示肌間ICCs（IC-MY）含量最為豐富，呈網絡狀包繞在肌間神經節(jié)細胞周圍，肌

10、層內ICCs（IC-IM）數量也較多，與平滑肌細胞平行分布，粘膜下ICCs（IC-SM）的數量最少。用兔抗人nNOS多克隆抗體標記NOS神經，免疫組織化學染色，熒光顯微鏡檢測了標本冰凍切片及腸壁鋪片中NOS神經元及神經纖維的分布情況，結果顯示，在縱行肌和環(huán)形肌之間，NOS陽性神經元和神經纖維形成網絡狀結構，肌層內也有較多的NOS陽性神經纖維平行于平滑肌細胞分布。應用c-kit與nNOS雙重染色檢測了結腸壁中ICCs和NOS陽性神經元及神

11、經纖維的位置關系，結果顯示，NOS陽性神經纖維與ICCs之間密切接觸，ICCs與平滑肌細胞的接觸也很密切。上述實驗結果提示，小兒結腸壁內的Cajal間質細胞已形成正常的規(guī)律性分布，并與腸神經及平滑肌之間存在著密切接觸，可能由此形成腸壁規(guī)律性舒縮的結構基礎。 第三部分 Cajal間質細胞在先天性巨結腸病中的異常變化 選擇確診為先天性巨結腸的患兒21例，其中普通型巨結腸16例，全結腸型巨結腸（TCA）5例，取巨結腸根治術標本

12、痙攣段全層腸壁作為實驗組，另取7例正常結腸相應節(jié)段標本作為對照組，冰凍切片，片厚10μm。用小鼠抗人c-kit單克隆抗體（CD117）作標記，免疫組織化學染色，熒光顯微鏡檢測了實驗組及對照組結腸標本冰凍切片中ICCs的分布狀況，結果顯示，與正常組結腸相比，實驗組各結腸標本中三種亞型的ICCs（IC-MY，IC-IM，IC-SM）數量均明顯減少，有顯著差異（P<0．01），與普通型巨結腸相比，肌間ICCs（IC-MY）在全結腸型巨結腸中的

13、數量減少更為明顯，有統(tǒng)計學差異（P<0．01），而粘膜下ICCs（IC-SM）和肌內ICCs（IC-IM）的分布則無明顯差異性（P>0．05）。用兔抗人nNOS多克隆抗體標記NOS神經，免疫組織化學染色，熒光顯微鏡檢測了兩組標本冰凍切片及腸壁鋪片中NOS神經元及神經纖維的分布情況，結果顯示，實驗組NOS陽性神經元及神經纖維數量明顯減少，甚至缺失，與對照組相比，差異顯著（P<0．01）。應用c-kit與nNOS免疫熒光雙重染色，檢測了兩組

14、標本冰凍切片中ICCs和NOS陽性神經的位置關系，結果顯示NOS陽性神經元及神經纖維與ICCs位置疏遠，無密切接觸。同時，我們還將收集到的結腸標本的肌層，勻漿后提取總RNA和蛋白，應用逆轉錄多聚酶聯反應（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR），在mRNA水平上檢測正常結腸和HD痙攣段結腸c-kit基因、nNOS基因與看家基因GAPDH的表達，用Western blo

15、t方法檢測兩組標本中c-kit蛋白及nNOS蛋白的表達，對實驗結果條帶進行半定量分析，結果證實，先天性巨結腸病變腸壁內c-kit蛋白和mRNA表達明顯降低（P<0．01），nNOS蛋白與mRNA表達也明顯減少（P<0．01）。以上實驗結果提示，無神經節(jié)性巨結腸病患兒病變段結腸壁內三種亞型的Cajal間質細胞的數量明顯減少甚至缺失，病變段腸管必然喪失產生電慢波的能力，同時NOS陽性神經元及神經纖維的數量也明顯降低，導致或加劇了巨結腸病變段

16、腸管的功能紊亂。 結論： 1、本課題成功地對Wistar大鼠結腸Cajal間質細胞進行了分離和體外培養(yǎng)，體外培養(yǎng)的ICCs可以形成獨立網絡狀結構，從而為這種細胞的深入研究提供技術支持。 2、小兒結腸壁內的Cajal間質細胞和NOS陽性神經網絡狀結構已經形成，具有了調控結腸運動的結構基礎，肌間神經叢中NOS陽性神經元與肌間ICCs（IC-MY）關系密切，NO能神經可能對肌間ICCs（IC-MY）起調節(jié)作用。