1、研究背景和目的：:
　　 目前惡性腫瘤的治療之所以失敗的因?yàn)?一是耐藥性,二是無(wú)法防治腫瘤的轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤在診斷時(shí)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率為1/3-1/4。而腫瘤致死亡的主要因?yàn)榫褪悄[瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,90％腫瘤患者最終死于轉(zhuǎn)移。但當(dāng)前人們對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制缺乏系統(tǒng)而深入的認(rèn)識(shí)；現(xiàn)行臨床治療手段對(duì)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移基本無(wú)效；故尋找腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子,揭示腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制便成為當(dāng)今腫瘤研究面臨的最大挑戰(zhàn)及國(guó)際研究的熱點(diǎn)。
　　 腫瘤細(xì)胞的侵

2、襲轉(zhuǎn)移涉及腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞和基質(zhì)之間的多個(gè)步驟和分子反應(yīng)。目前腫瘤轉(zhuǎn)移步驟的模式廣為人們接受的是Liotta提出的癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的三步驟假說(shuō):1.腫瘤細(xì)胞之間的解黏附和腫瘤細(xì)胞與ECM之間的黏附；2.侵足的形成與ECM的降解:腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞分泌的蛋白水解酶,使腫瘤細(xì)胞周?chē)陌l(fā)生降解；3.運(yùn)動(dòng),腫瘤細(xì)胞被生長(zhǎng)因子及趨化因子誘導(dǎo),向縱深運(yùn)動(dòng)。值得一提的是,雖然上述個(gè)階段涉及到相對(duì)特異的分子機(jī)制,但是侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中各階段之間的分子存在交

3、叉和相互作用,因此侵襲轉(zhuǎn)移的階段和分子功能劃分只是相對(duì)的。
　　 已有研究證明,正常組織細(xì)胞在特殊情況下也具備遷移能力,如胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、免疫細(xì)胞。而腫瘤細(xì)胞由正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)演變,形成強(qiáng)于正常組織細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。腫瘤細(xì)胞雖然具備自身特點(diǎn),但由于來(lái)源于正常組織細(xì)胞,因此在很多方面還是原有功能的沿用或是增強(qiáng)。而當(dāng)今一些腫瘤轉(zhuǎn)移重大發(fā)現(xiàn)采用了類(lèi)比的方式,跨學(xué)科從生理學(xué)中尋找對(duì)于正常細(xì)胞遷移的重要分子,試圖找到對(duì)于腫瘤細(xì)胞至關(guān)重要的轉(zhuǎn)

4、移相關(guān)因子。比如腫瘤生物學(xué)最新研究表明:在胚胎發(fā)育中起重要作用的上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)便是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。我們的研究思路正是采用這種交叉學(xué)科間的類(lèi)比思維,試圖通過(guò)尋找在正常細(xì)胞中證實(shí)已與細(xì)胞遷移密切相關(guān)的因子,同時(shí)收集5大瘤種10株轉(zhuǎn)移能力不同的腫瘤細(xì)胞,從基因和蛋白水平比較,而非采取常規(guī)的高通量基因蛋白芯片,試圖找到與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力相關(guān)的分子而進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)

5、行深入研究。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研,我們認(rèn)為瞬時(shí)受體電位通道家族之一的TRPM7可能與腫瘤細(xì)胞的遷移相關(guān),初步證據(jù)如下:
　　 瞬時(shí)受體電位通道(TRP channels)是位于細(xì)胞膜上的一類(lèi)重要的陽(yáng)離子通道超家族。TRP通道分為:TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP和TRPML 6大亞家族。TRPM(Melastatin)亞家族包括TRPM1-8,共8種亞型。TRP通道為非選擇性陽(yáng)離子通道,TRPM7通道主要通過(guò)的離子為鈣離

6、子、鈉離子,其還可通過(guò)鎂、鋅、錳等很多二價(jià)離子。
　　 北京大學(xué)程和平等運(yùn)用共聚焦顯微成像技術(shù),發(fā)現(xiàn)遷移成纖維細(xì)胞頭部存在大量微小而短暫的鈣信號(hào)事件,即“鈣閃爍”現(xiàn)象,并證明鈣閃爍起著掌控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)“方向舵”的作用。實(shí)驗(yàn)條件下,鈣閃爍被抑制的細(xì)胞可以維持直線運(yùn)動(dòng),但完全喪失了定向和轉(zhuǎn)彎的能力。進(jìn)而提出了“鈣閃爍引導(dǎo)細(xì)胞定向遷移”的新觀點(diǎn):在外界趨化因子梯度誘導(dǎo)下,鈣閃爍發(fā)放呈現(xiàn)不對(duì)稱(chēng)特性,即趨化因子濃度高的一側(cè),鈣閃爍更為活躍,驅(qū)

7、動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)向此側(cè),從而精確地調(diào)控細(xì)胞的定向遷移。而在文章中作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證:在所有可能的TRP通道中,TRPM7通道是唯一調(diào)控遷移細(xì)胞前端的“鈣閃爍”現(xiàn)象的通道蛋白,即TRPM7才是真正掌控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的“方向舵”,并以此來(lái)指引細(xì)胞跟隨趨化因子梯度進(jìn)而有目的的定向遷移。
　　 此外,Kristopher Clark等發(fā)現(xiàn)在小鼠N1E-115神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中,TRPM7介導(dǎo)緩激肽(BK)誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流:同時(shí)過(guò)表達(dá)TRPM7可以促進(jìn)該細(xì)胞

8、的伸展并增強(qiáng)細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附；此外TRPM7的激活還可以導(dǎo)致激酶依賴(lài)的足體的形成。而對(duì)于足體,目前研究表明:正常細(xì)胞的足體與腫瘤細(xì)胞的侵足關(guān)系密切,人們推測(cè)足體是侵入性偽足的前體,在一定條件下形成穩(wěn)定的侵入性偽足。足體在生理物質(zhì)上顯示出降解細(xì)胞外基質(zhì)的功能。我們也可以由此推測(cè):TRPM7也可能在腫瘤細(xì)胞中通過(guò)導(dǎo)致侵足的形成繼而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。另外,還有研究表明:TRPM7可與細(xì)胞膜表面的馬達(dá)蛋白myosinⅡ相互作用,從而通

9、過(guò)調(diào)控細(xì)胞骨架解除細(xì)胞與基質(zhì)的粘附進(jìn)而影響細(xì)胞的伸展。
　　 綜上,TRPM7已被證明的一系列細(xì)胞遷移相關(guān)的作用與腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲的各個(gè)階段均具有相關(guān)性,故我們大膽推測(cè):TRPM7可能是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控分子。
　　 方法:
　　 1.腫瘤細(xì)胞株的選取及TRPM7基因/蛋白水平表達(dá)的差異檢測(cè)
　　 選取分屬鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、大腸癌、肝癌等5大瘤種中已公認(rèn)轉(zhuǎn)移能力不同的10株腫瘤細(xì)胞株為研究對(duì)

10、比對(duì)象。運(yùn)用RT-PCR和Western Blot從基因和蛋白兩個(gè)表達(dá)水平檢測(cè)不同瘤種的腫瘤細(xì)胞高低轉(zhuǎn)移能力株之間TRPM7表達(dá)量是否存在差異,發(fā)現(xiàn)差異后應(yīng)用免疫細(xì)胞熒光技術(shù)檢測(cè)TRPM7在陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)部位和情況。選取該癌種的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞(高表達(dá)TRPM7)和低轉(zhuǎn)移細(xì)胞(低表達(dá)TRPM7)分別進(jìn)行后續(xù)的RNA干擾、基因轉(zhuǎn)染及進(jìn)一步的功能和機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究。
　　 2.瞬時(shí)干擾TRPM7對(duì)人鼻咽癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株5-8F遷移能力的

11、影響
　　 利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)瞬時(shí)干擾高表達(dá)TRPM7的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株5-8F的TRPM7 mRNA表達(dá)量,經(jīng)RT-PCR、Western Blot檢驗(yàn)TRPM7的干擾效果。體外分別用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)已成功干擾細(xì)胞的遷移能力變化。
　　 3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TRPM7對(duì)人鼻咽癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株6-10B遷移能力的影響
　　 hTRPM7/pCDNA4/TO重組表達(dá)質(zhì)粒由美國(guó)西雅圖兒童醫(yī)院

12、Scharenberg實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并作為禮物贈(zèng)送我中心實(shí)驗(yàn)室,然后采用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000TM分別將空質(zhì)粒和TRPM7表達(dá)質(zhì)粒hTRPM7/pCDNA4/TO轉(zhuǎn)染進(jìn)入6-10B細(xì)胞,用zeocin篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆并擴(kuò)增培養(yǎng)。并應(yīng)用誘導(dǎo)劑Doxycycline誘導(dǎo)24小時(shí)后,應(yīng)用RT-PCR與Western Blot檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的TRPM7基因及蛋白表達(dá)水平改變。分別用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及transw

13、ell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移能力變化。
　　 4.TRPM7影響5-8F細(xì)胞遷移能力機(jī)制的初步探討
　　 利用熒光鈣染料Fura-2并通過(guò)熒光分光光度計(jì)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣變化情況,同時(shí)應(yīng)用各種TRPM7離子通道特異性和非特異性的激活劑和阻斷劑來(lái)探討TRPM7表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣變化影響的機(jī)制以及內(nèi)鈣變化對(duì)細(xì)胞遷移的影響。
　　 結(jié)論
　　 1.TRPM7基因/蛋白在鼻咽癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株5-8F中高表達(dá)而在

14、低轉(zhuǎn)移株6-10B中低表達(dá),表明TRPM7可能是促進(jìn)鼻咽癌轉(zhuǎn)移的潛在轉(zhuǎn)移相關(guān)分子和預(yù)后因子。
　　 2.TRPM7的表達(dá)高低決定了鼻咽癌細(xì)胞遷移能力的高低,提示TRPM7是鼻咽癌細(xì)胞的遷移相關(guān)分子。
　　 3.TRPM7是胞內(nèi)鈣變化的主要啟動(dòng)子和調(diào)控子,提示TRPM7很可能成為鼻咽癌患者治療的靶點(diǎn)。
　　 本研究的創(chuàng)新之處
　　 1.首次發(fā)現(xiàn)TRPM7與腫瘤轉(zhuǎn)移(鼻咽癌細(xì)胞遷移)相關(guān),為開(kāi)展鼻咽癌基因靶向

15、治療初步奠定了理論基礎(chǔ)；
　　 2.初步明確了TRPM7是鼻咽癌胞內(nèi)鈣變化的新的啟動(dòng)和調(diào)控分子,這對(duì)于研究控制鼻咽癌轉(zhuǎn)移提供了一個(gè)潛在治療和預(yù)后指標(biāo)；
　　 3.首次闡明了TRPM7如何影響鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)鈣變化從而影響細(xì)胞遷移以及腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在由TRPM7介導(dǎo)的外鈣內(nèi)流激活的鈣誘導(dǎo)鈣庫(kù)釋放(CICR)機(jī)制。
　　 4.利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立了TRPM7基因過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定鼻咽癌細(xì)胞株6-10B/TRPM7+,為研究TRP