1、目的:利用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進化(SELEX)技術，從體外合成的全長96bp其中包含60bp的隨機序列的寡核苷酸文庫中篩選出與金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)高親和力高特異性結合的適體。并利用篩選出的適體建立酶連接適體免疫吸附檢測法和膠體金標記適體的雙適體夾心斑點滲濾法用于快速鑒定SEB；同時對適體在體外抑制SEB超抗原活性的功能進行研究。 方法: 1.在體外構建兩端為固定序列，中間為60bp的隨機序列，全長96bp的寡

2、核苷酸文庫。以SEB為靶標，利用SELEX篩選技術，篩選出針對SEB高親和力高特異性的適體群，建立了適體標記熒光直接檢測法(aptamer labelledfluorescence direct assay，ALFDA)進行各輪ssDNA富集庫與SEB的結合力測定。 2.以地高辛—堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體系統(tǒng)作為橋連，間接連接酶與核酸，通過酶促底物顯色反應測定吸光度A值，對篩選出的適體群與SEB的結合力和部分相關蛋白進行比較

3、。同時利用該法測定了系列濃度的適體與SEB的結合力數(shù)據(jù)，通過軟件獲得解離常數(shù)Kd值進一步鑒定了適體與靶標的親和力。適體標記膠體金顆粒后，以斑點滲濾法為基礎鑒定篩選出適體的特異性。 3.將第11輪篩選產物分別進行擴增、純化，TA克隆、測序并用相關軟件分析其一級和二級結構。 4.微孔板包被抗SEB抗體作為捕獲分子，以酶橋連適體作為檢測信號建立的酶連適體免疫混合吸附法用于SEB的定量檢測。同時將針對SEB特異性適體包被在硝酸纖

4、維素膜上作為捕獲分子，以膠體金標記的適體作為報告分子，建立了金標雙適體夾心斑點滲濾法。 5.分析適體在體外對于SEB超抗原的功能學抑制作用。系列濃度的適體作用SEB后刺激人外周血單核淋巴細胞，利用MTT法測定PBMC的吸光度A值，并通過刺激指數(shù)(SI)分析增殖活性；同時利用ELISA檢測IFN-γ的分泌情況。 結果: 1.隨著篩選輪數(shù)的增加，SEB與ssDNA富集庫的結合力也顯著增高。13輪后結合力從最初的1.1

5、％上升至39.8％，提高了36倍。當ssDNA富集庫與SEB的結合位點達到一個飽和狀態(tài)時，吸附到靶標上的ssDNA就不再增加。 2.利用酶連接核酸的酶促顯色反應測定A值，鑒定適體與SEB的結合能力，結果顯示篩選出的適體與SEB反應后的吸光度值為1.02，明顯高于SPA的0.35、BSA的0.32，和空白對照0.28。通過軟件分析，適體與SEB的解離常數(shù)Kd值可低至21.9nM。金標適體能夠特異性識別結合SEB，膜上呈現(xiàn)陽性反應，

6、結果與酶連接核酸結果相符合。 3.11輪產物進行克隆測序，經序列比對后發(fā)現(xiàn)25個測定序列中有兩對序列明顯富集，幾乎完全一致，同源性達95％以上，利用Chromas和DNAman軟件進行序列分析一級結構，按照同源性分成7個家族，利用DINAMelt sever軟件分別模擬出7個家族的二級結構主要以莖環(huán)、G—四聚體為主。 4.建立了酶連接適體免疫吸附混合檢測法用于測定SEB的定量檢測，當SEB濃度在0.1～20ug/ml具有

7、較好的線性關系。利用雙適體夾心斑點滲濾法對SEB進行定性檢測，SEB被特異性適體捕獲后，與金標適體反應膜上可出現(xiàn)紅色斑點，而SPA、BSA、正常血清和空白對照均無顏色變化。 5.適體在體外對SEB的功能學研究發(fā)現(xiàn)，當適體濃度達到200nmol/L時，PBMC的SI值降低至1.03，IFN—γ分泌量減少至25ng/ml，差異具有明顯的統(tǒng)計學意義。細胞實驗顯示適體對SEB促PBMC增殖的超抗原活性具有一定的抑制作用。 結論:

8、 本研究運用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進化(SELEX)技術，成功篩選到針對SEB的高親和力和高特異性的ssDNA適體群。利用篩選到的針對SEB特異性適體群，建立酶連接適體免疫混合夾心法和金標雙適體夾心斑點滲濾法用于SEB定量、定性快速檢測；具有良好的靈敏度與特異性。通過細胞增殖試驗和細胞因子定量分析顯示適體在體外對SEB的超抗原活性具有明顯的抑制作用。利用SELEX技術篩選SEB特異性適體為感染金黃色葡萄球菌產生SEB的臨床快速鑒定和