1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化(AmyotrophicLateralSclerosis，ALS)是運動神經(jīng)元病中最常見的類型，該病的特點是上下運動神經(jīng)元變性，上運動神經(jīng)元受累表現(xiàn)為痙攣、構(gòu)音障礙和吞咽困難等;下運動神經(jīng)元受累表現(xiàn)為肌肉萎縮、肌束顫動等。大約90％的肌萎縮側(cè)索硬化病例為散發(fā)性(sporadicALS，sALS)，10％為家族性肌萎縮側(cè)索硬化(familialALS，fALS)。1/5的fALS病例與突變的銅鋅超氧化物歧化酶Ⅰ型(Cu

2、/Znsuperoxidedismutase1，SOD1)有關(guān)。其中以突變的G93A位點最常見，即基因密碼子第93位點上的丙氨酸被甘氨酸替代。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為進行性加重的運動神經(jīng)元變性，與人類運動神經(jīng)元病相似，是國際上公認研究ALS的動物模型。
　　用轉(zhuǎn)染了人類突變的SOD1(humanmutantSOD1，hmSOD1)的轉(zhuǎn)基因小鼠進行實驗研究，發(fā)現(xiàn)hmSOD1通過很多途徑損害運動神經(jīng)元，例如:氧化應激反應、錯誤

3、折疊/未折疊蛋白聚集、線粒體功能受損、谷氨酸興奮毒性等。近年來許多學者提出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激學說。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個多功能細胞器，它是蛋白質(zhì)的合成、加工處理和折疊的場所，也是鈣離子的儲存庫。當鈣離子平衡紊亂或錯誤折疊/未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚時就可以誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，緊接著觸發(fā)未折疊蛋白反應來輔助蛋白質(zhì)折疊以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。適當?shù)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以起到細胞保護功能，但細胞中發(fā)生過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激則可以引起細胞功能障礙，甚至細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表

4、面存在三種跨膜蛋白，分別為PERK(PKR-likeERkinase)、ATF6(activatingtranscriptionfactor6)和IRE1(inositol-requiringenzyme1)。當發(fā)生ERS時，這幾種蛋白分別與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分子伴侶GRP78分離而被激活，激活的蛋白分別介導三條通路。
　　PERK通路是三條通路中最早被激活的，PERK與GRP78分離后通過自身的二聚化和磷酸化而被激活，磷酸化的PERK（

5、pPERK）使eIF2α51位絲氨酸發(fā)生磷酸化，從而使蛋白質(zhì)的合成減緩或者停止。磷酸化的eIF2α(peIF2α)激活ATF4，引起ERAD、GADD34、CHOP蛋白表達的增多，GADD34負反饋性的調(diào)節(jié)eIF2α的磷酸化。磷酸化的PERK在激活eIF2α的同時也使Nrf2（NuclearFactorErythroid2-RelatedFactor2）與Keap1分離并活化，活化的Nrf2由細胞漿轉(zhuǎn)移到細胞核，并需要在ATF4的協(xié)同作

6、用下上調(diào)二相解毒酶的表達，從而促進細胞存活。
　　TarasAfonyushkin等人研究表明eIF2α上調(diào)ATF4的翻譯，而Nrf2上調(diào)ATF4mRAN的轉(zhuǎn)錄。Nrf2和ATF4相互結(jié)合后與一些二相解毒酶基因上的ARE序列結(jié)合，上調(diào)二相解毒酶的表達，以此調(diào)節(jié)細胞的氧化還原平衡，維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。
　　本實驗通過與Nrf2-/-小鼠雜交制備敲除Nrf2的hmSOD1G93A小鼠，并以此為研究對象，使用免疫組織化學及激光共聚

7、焦方法研究不同時期運動神經(jīng)元數(shù)目及ATF4表達部位變化情況，通過免疫印跡方法研究ATF4在不同時期小鼠的變化情況及Nrf2對其表達的影響情況。
　　方法:
　　1、動物模型的飼養(yǎng)及鑒定
　　所有小鼠均飼養(yǎng)在SPF（specificpathogenfree）環(huán)境中，即恒濕、恒溫(25-27℃)以及無特定病原菌的環(huán)境，以無菌水、及滅菌的SPF級顆粒鼠糧喂養(yǎng)。動物實驗的過程遵守河北省實驗室動物管理規(guī)定。實驗所用小鼠均從美國J

8、ackson實驗室(BarHarbor,ME，USA)買進。將SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠與Nrf2-/-小鼠雜交，制備Nrf2敲除的SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠。采用剪取子代小鼠尾尖的方法獲取子代小鼠的DNA，利用PCR擴增技術(shù)，鑒定是否帶有Nrf2及SOD1G93A基因。
　　2、免疫印跡
　　按照SnowRJ的評分標準將實驗小鼠分為癥狀前期組（0分，約出生后60天）、癥狀早期組（2分，約出生后90天）和終末期組（5分，約出

9、生后120天），每組均設立同窩同性別同年齡對照。新鮮獲取小鼠腰髓，保存于-80℃冰箱備用。采用抽提裂解法提取蛋白，通過westernbolt方法測定ATF4在Nrf2+/+G93A轉(zhuǎn)基因小鼠不同時期的表達并在終末期小鼠中研究敲除Nrf2對ATF4表達的影響。
　　3、免疫組化
　　將Nrf2+/+G93A轉(zhuǎn)基因小鼠分為三組（癥狀前期、癥狀早期和終末期），每組均設立同窩同性別同年齡對照。用多聚甲醛固定小鼠的腰髓。振蕩切片后，保

10、存于4℃?zhèn)溆谩⑿∈笱柽M行ATF4免疫組化染色。
　　4、激光共聚焦
　　腰髓標本經(jīng)4％多聚甲醛固定后，用振動切片機切成25um厚的薄片，與免疫組化步驟相似，一抗孵育后，F(xiàn)ITC、Cy5分別標記羊抗兔、羊抗鼠二抗。并加Hochest核熒光染色劑孵育后，抗衰減熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察抗體分布位置，探討Nrf2對ATF4表達部位的影響。
　　結(jié)果:免疫印跡方法觀察ATF4在轉(zhuǎn)基因小鼠的表達量，發(fā)現(xiàn)對照組小鼠表

11、達量較少，且在60-120天之間隨年齡的增長無明顯差異性。在Nrf2+/+G93A小鼠的腰髓中，ATF4的表達在癥狀前期就有所升高（P＞0.05），在癥狀早期明顯升高(P＜0.05），終末期有所下降（P＜0.05）。ATF4在Nrf2+/+G93A終末期小鼠的表達比在Nrf2-/-G93A終末期小鼠顯著升高(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果顯示隨著疾病的進展運動神經(jīng)元細胞數(shù)逐漸減少，且組織出現(xiàn)空泡化，ATF4的表達在癥狀前期較對照組無明顯差